翻译：周之超@UW-Madison

基因组水平解析的宏基因组学揭示了地下水生态系统中附生性CPR细菌和DPANN古菌的位点特异性多样性

Genome-resolved metagenomics reveals site-specific diversity of episymbiotic CPR bacteria and DPANN archaea in groundwater ecosystems

Nature Microbiology [IF: 15.540]

DOI：https://doi.org/10.1038/s41564-020-00840-5

发表日期：2021-1-25

第一作者：Chritine He¹

通讯作者：Jill Banfield
(jbanfield@berkeley.edu)^1,4,9

合作作者：Ray Keren,Michael L. Whittaker,Ibrahim F. Farag, Jennifer A. Doudna,Jamie H. D. Cate

主要单位：

^1,4,9美国加州大学伯克利分校(Innovative Genomics Institute, University of California, Berkeley, CA, USA,Department of Earth and Planetary Sciences,
University of California, Berkeley, CA, USA,Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley, CA, USA)

写在前面

分享标题：Nature子刊：加州大学伯克利分校Jill Banfield组揭示CPR细菌和DPANN古菌多样性及与低温TEM下宿主互作关系

摘要

候选辐射门(CPR)细菌和DPANN古菌通常是在地下水中被检测到的未分离的小细胞共生体。地下水地球化学对CPR菌和DPANN古菌的丰度、分布、分类多样性和宿主关联的影响尚未被研究。在此，我们对一个农业和七个原始地下水微生物群落进行了基因组水平的宏基因组学分析，共回收了746个CPR和DPANN基因组。作为当地饮用水来源的原始地下水采样点含有高达31%的CPR细菌和4%的DPANN古菌。我们观察到在地下水采样点上，宏基因组组装基因组(MAGs)的物种水平重叠很少，表明CPR和DPANN群落可以根据物理化学条件和宿主群体进行区分。低温透射电子显微镜成像和基因组分析使我们能够识别CPR和DPANN谱系，它们可重复地附着在宿主细胞上，并表明CPR细菌的生长似乎是由附着在宿主细胞表面而刺激的。我们的分析揭示了CPR细菌和DPANN古菌的位点特异性多样性，它们与地下水含水层中的不同宿主共存。鉴于CPR和DPANN生物已在人类微生物组中被识别，它们的存在与牙周炎等疾病相关，我们的发现有助于重新思考饮用水质量和人类健康的关系。

背景

基于宏基因组的系统发育分析导致了两组缺乏纯培养代表的生物—CPR细菌和DPANN古菌的发现和归类。虽然多样性高，但CPR和DPANN只具有生物保守的特征，表明其共生生活方式，其具有体积超小，基因组小，生物合成能力最低等特征。与细菌或古细菌宿主共生的现象(表面附着)在很多研究中都被报到过，例如：Saccharibacteria与Actinobacteria共生培养物，Nanoarchaeota和Crenarchaeota共生培养物，Nanohaloarchaeota、ARMAN(里士满矿嗜酸纳米微生物)和Euryarchaeota共生培养物，CPR门的成员Parcubacteria生活在原生菌内等等。CPR和DPANN生物无处不在，它们在地下水中可能很丰富，参与生物地球化学循环。CPR细菌通过多种处理后可以继续在饮用水中存在，从而引发出了人类微生物体中检测到CPR和DPANN是不是由于来源于地下水的问题。

CPR和DPANN生物在地下水环境中的丰度和分布的变化，它们的作用及其与宿主生物的关系都没有得到很好的描述。地下环境如地下水难以取样，但与地表环境相比研究内容较少，尽管它们估计含有90%全部细菌的生物量。CPR/DPANN的丰度在基因组调查中很可能被低估了，因为它们细胞体积小，可以通过被广泛用于收集细胞0.2µm的过滤器。此外，发散或含有内含子的16SrRNA基因的“普遍”引物不太可能检测到这两个组的许多成员。大多数接近完整的CPR和DPANN基因组只来自两个地下含水层。在本文中，为了调查CPR和DPANN在地下水生态系统中的作用，我们应用基因组水平解析的宏基因组学分析了加州北部的8个地下水群落，同时我们也使用了低温透射电子显微镜(低温TEM)来拍摄CPR/DPANN生物数量最高的群落的显微图像。

结果

宏基因组取样和MAG组装

Metagenome sampling and MAG assembly

在2017至2019年期间，对北加利福尼亚8个地下水群落的浮游组分进行了采样(图.1)，其中使用大量过滤器(0.1µm过滤器)。一些地点还采用不同尺寸过滤(2.5µm、0.65µm、0.2µm和0.1过滤器)平行取样。该企业需要通过专用的顺序过滤装置从每个地点抽取400-1,200升地下水，以回收足够的生物量，用于对每个大小部分进行深度测序(见方法)。一个地点(Ag)是一个受农业影响的河流沉积物含水层，其余地点是沉积岩和火山岩混合物中的原始地下水含水层(Pr1-Pr7，编号为CPR和DPANN生物丰度的递减顺序)。在先前的宏组学研究中，在Ag位点发现的CPR/DPANN生物的高丰度和多样性的基础上，我们在15个月内取了5个时间点的样品。

图 1 地下水群落的采样和概述

Sampling and overview of groundwater communities

a,本研究中采样的8个北加州地下水点地图(图片来自谷歌地图)。插图：地质图(i)-(ii)显示采样区域(黑框)。J：海洋沉积和变质沉积岩(侏罗纪)、KJfm：海洋沉积和变质沉积岩(白垩纪-侏罗纪)、Q：海洋和非海洋(陆相)沉积岩(更新世-全新世)、Qv：海相沉积岩和变质岩(白垩纪-侏罗纪)、um：深成岩(中生代)、K：海相沉积岩(上新世)、Kl：海相沉积岩和变质沉积岩(下白垩纪)、Ep：海相沉积岩(古新世)、E：海相沉积岩(始新世)、QPc：非海洋(陆相)沉积岩(上新世-更新世)、Tv：火山岩(第三纪)。比例尺，23.3km(大地图)、3.2km(i和ii)和9.7km(ii);

b,在每个位点检测到的rpS3基因的门水平分解显示(CPR和DPANN超门除外)。图中注明了每个现场的取样日期;

c,Rank丰度曲线显示每个样点相对覆盖度最高的30rpS3基因。小插图数据条表明一个未bin的rpS3基因。

根据GC含量、覆盖度、核糖体蛋白和单拷贝基因或者基因副本、四核苷酸频率和样本覆盖模式，使用宏基因组数据对细菌和古菌基因组分箱binning。使用DAS工具选择最高质量的bin，然后手动优化bin。一个给定样点的所有bins在99%的平均核苷酸相似度(ANI)标准下去重，结果得到所有样点的2007个去重基因组(完整性≥70%和污染度≤10%)。中位基因组完整性>90%，且高达58%的宏基因组reads覆盖到每个样点的去重基因组集。在这个去重的基因组集合中，有540个和206个基因组分别被归类为CPR细菌和DPANN古菌。

评估地下水微生物群落基因组水平的相似性，我们使用ANI聚类此次研究中的2007个基因组和来自之前研究富含CPR/DPANN的两个地下水样点的3044个基因组：犹他州的水晶间歇泉和一个位于科罗拉多州Rifle毗邻科罗拉多河的地下含水层。在菌株水平上(>99% ANI)，分析位点的基因组几乎没有相似性；尽管Pr1和Pr6相临(邻近位点之间距离~1km)且很多样点位于深成岩中，多个样点之间仅仅共享一个或不共享菌株。唯一一对共享多个菌株(>99%ANI)的位点是Pr1和Pr7，它们之间共享44个菌株，其中包括7个CPR菌株。这两个地点的含水层不太可能连接起来，因为它们位于普塔河的不同两侧，这是一个主要的水文特征。此外，我们没有将观察到的基因组相似性归因于测序过程中的index hopping。即使在物种水平上(>95% ANI)，大多数分析样点共享不超过一个物种。这十个地下水群落在门、物种和菌株水平上总体缺乏基因组相似性表明，基于当地水文地球化学条件，微生物种群存在高度分化。

CPR/DPANN的丰度和多样性

Abundance and diversity of CPR/DPANN organisms

我们首先试图描述和比较八个地下水群落的组成，并且特别侧重于CPR和DPANN。为了广泛地调查微生物群落组成，我们使用核糖体蛋白uS3(由RPS3编码)作为单拷贝标记基因，因为它具有很强的系统发育信号。对RPS3基因与回收基因组的比较表明，除了Pr2位点外，每个样点上大多数最丰富的生物体都由基因组bin所表示了(图1c, 小窗口的数据条表示未bin的RPS3基因)。我们发现所有地下水群落在门水平组成上都是不同的(图1b，c)。在主成分分析的基础上，Ag位点和原始地下水位点之间存在很强的区隔。在“富含CPR/DPANN的农业影响地下水样点”部分里，我们进一步详细研究了Ag地下水群落的变化。

具体来说，CPR和DPANN种群在样点之间是相当不同的(图2a)，即使一些CPR和DPANN谱系在样点之间分布相当普遍。在所有的样点中，CPR和DPANN分别占群落的3-40%和0-24%(通过在0.1µm过滤器上的大量过滤来测量)。与原始地下水样点相比，Ag地下水中的DPANN古菌丰度(10-24%)要高得多，其中DPANN生物占群落的<5%。在所有的位点中，从CPR中目前鉴定的73个门水平中的58个和DPANN中目前鉴定的10个门水平中的6个中解析到了基因组(图2b)。特别是，从Ag地下水中解析的CPR基因组覆盖了CPR内部的大部分多样性(图2b，实心黑色的圆圈)。根据16S rRNA基因序列相似度(门水平相似度为<76%)和串联核糖体蛋白系统发育定位来看，我们在CPR中定义了两个新的门水平谱系，每个序列由Ag和Pr1地下水的序列组成。我们建议为这些新的门水平谱系命名“Candidatus Genascibacteria”和“Candidatus Montesolbacteria”(图2b，灰色标记)，命名基于发现这两类菌代表性序列的两个样点的名字。

图 2 CPR和DPANN生物在地下水位之间的分布

Distribution of CPR and DPANN organisms across groundwater sites

a,在所有样点中，DPANN(上)和CPR(下)内门水平谱系的丰度(含有RPS3标记基因的scaffold的相对覆盖度)。条形图上的数字表示从宏基因组reads中解析的草图质量(>70%覆盖度，<10%污染度)的去重DPANN或CPR基因组数;

b,基于14个串联核糖体蛋白的DPANN(顶部)家族和基于15个串联核糖体蛋白的CPR(底部)的最大似然系统发育树。CPR中的门水平谱系被折叠起来。每个谱系旁边的标记表示地下水位点，其中至少有一个具有代表性的基因组从该谱系中恢复。新的CPR系“Candidatus Genascibacteria”(在绿色的Microgenomates超级门中)和“Candidatus Montesolbacteria”(在紫色的Parcubacteria超级门中)以灰色突出显示。

CPR/DPANN生物在生物地球化学循环中的作用

Roles of CPR/DPANN organisms in biogeochemical cycling

接下来，考虑到CPR和DPANN的丰富程度，我们试图研究这些生物在这八个地下水群落中的潜在代谢作用。由于大多数CPR/DPANN生物被预测为共生体，很可能它们在一个群落中的代谢作用随其宿主生物的代谢能力而变化。为了研究这一关系，我们根据一组预定的蛋白质隐马尔可夫模型(HMMs)对所有解析的基因组进行了分析，并利用基因组相对覆盖度对整个群落的代谢谱进行了比较(图3a)。Ag地下水的代谢特征与原始地下水的代谢特征有明显的区别。在从邻近的农业活动中接收高氮输入的Ag地下水中，氨被七个能产生anammox(厌氧氨氧化)作用(占群落8%)的Planctomycetes氧化，这样导致Ag地下水中的氨水平较低(图3a)。Ag样点中的亚硝酸盐氧化能力大于硝酸盐还原能力，这与测量得到的高硝酸盐(165 mg l−1 NO3-N)和低亚硝酸盐(<0.05 mg l−1 NO2-N)水平一致(图3a)。大多数采样的地下水群落具有不完全的反硝化能力，与之前的步骤相比，编码一氧化二氮还原的最后一步所需基因的基因组要少得多。与其他地下水群落相比，Pr3和Pr4是除固氮、硫代硫酸盐歧化、硫化物氧化和碳固定外，具有更大的一氧化二氮还原能力的两个位点(图3a)。虽然Pr3和Pr4在物种水平上几乎没有重叠，但它们在群落水平的代谢能力上的相似性可能反映了它们在地理上接近(<1km)和相似的地下水化学物质(铵根-N、硝酸盐-N、二氧化氮-N和硫酸盐-S的水平)。

图 3 地下水群落的代谢特征

Metabolic profile of groundwater communities

a,生物地球化学循环图描述了本研究中取样的三个地下水位点的群落水平代谢潜力。能够执行该步骤的所有基因组的总相对丰度，以及包含该步骤功能的基因组数量，都列在每个代谢步骤旁边。箭头大小与能够进行代谢步骤的基因组的总相对丰度成正比;

b,本研究的746个CPR和DPANN基因组的热图(行是门级谱系，括号中的数字是解析的基因组数量)。热图显示了含有各种代谢和生物合成功能所需关键基因的基因组的百分比。

我们专门检查了CPR和DPANN基因组中的关键代谢标记基因，以评估它们可能具有哪些代谢作用(图3b)。亚硝酸盐还原酶nirK在19个CPR和4个DPANN基因组中的存在以及nosD在11个DPANN基因组中的存在表明许多CPR/DPANN谱系在反硝化过程中起着互补或辅助作用(与以前在Parcubacteria发现中nirK基因的情况一致)。此外，Ag地下水中的13个DPANN基因组编码亚硝酸盐还原酶(nirD)的小亚基，但缺乏催化大亚基nirB，表明DPANN生物在亚硝酸盐还原成氨中起辅助作用。在Ag、Pr1和Pr3样点中，我们发现30个DPANN基因组和3个CPR基因组编码硫双加氧酶sdo基因，而几十个不同的CPR和DPANN基因组编码参与硫酸盐还原的sat、cysC和cysN，这表明CPR和DPANN生物在向亚硫酸盐转化的过程具有潜在的功能。

一个富含CPR/DPANN生物的受农业影响的地下水位点

An agriculturally impacted groundwater site rich in CPR/DPANN
organisms

在确定CPR和DPANN生物在地下水群落中的普遍性和代谢作用后，我们对Ag地下水进行了时间和大小过滤取样(图4a)来研究这些特征是如何随着时间和环境因素而变化的。非计量多维尺度(NMDS)排序表明，如预期的那样，大多数CPR和DPANN基因组聚集在一起，远离其他细菌和古菌，以普遍的0.1~0.2µm的片段区分(图4b)。在排序空间中，没有可观察到按照采样时间的基因组聚类，同时随着时间的变化基因组的相对丰度中位均方根偏差(r.m.s.d)为~0.002(图4c)，表明在菌株水平上这是一个非常稳定的群落(基因组在99% ANI标准下去重)。
r.m.s.d在个体基因组丰度模式的检查下>0.004(图4d，e)显示了Planctomycetes和几种CPR细菌之间的共丰度模式，虽然结果不是确定的，但这可能是由CPR-宿主寄生关系造成的。两种Ignavibacteria和Betaproteobacteria与一种Uhrbacteria共存(图4d)可能是共生关系或相互关系的CPR-宿主关系的迹象。这些观察到的时间趋势值得进一步研究，以确定它们是否反映了共生关系。

图 4 Ag地下水微生物群落随时间的变化

Ag groundwater microbial community over time

a,随着时间的推移，在Ag样点非CPR细菌、CPR细菌、DPANN古细菌和非DPANN古菌基因组(总共1103个)的相对丰度;

b,NMDS分析1103个Ag基因组在所有时间点的相对丰度。基因组在ordination空间中的位置显示在顶部图中，而样本在ordination空间中的位置显示在底部图中。底部图中，B-0.1为0.1µm过滤器(圆形)上的大量过滤，S-2.5为2.5µm尺寸组分(三角形)，S-0.65为0.65-2.5µm尺寸组分(交叉)，S-0.2表示0.2-0.65µm尺寸组分(加符号)，S-0.1表示0.1-0.2µm尺寸组分(闭合正方形);

c,框图显示了随着时间的推移，大体积过滤(0.1µm过滤器上的整个群落)中的所有基因组相对丰度的r.m.s.d值。中值r.m.s.d(橙色线)<0.001，表明Ag中个体基因组的相对丰度随时间的变化很小;

d,e,r.m.s.d>0.004的非CPR菌(d)和CPR菌(e)随时间变化的相对丰度。基因组是在图例中通过门、百分比GC和覆盖度来识别的，代表基因组是从在原始时间点(括号中的后两个)解析出来的;

f,随着时间的推移，碳、氮、硫和杂项元素循环中Ag群落水平功能的变化(具有广泛的代谢功能所有基因组的总相对丰度);

对于d-f,蓝色和橙色背景分别表示北加利福尼亚的雨季和干旱季节。

随着时间的推移，Ag地下水代谢循环能力的变化表明，有机碳氧化、固碳、发酵、亚硝酸盐氧化、一氧化氮还原和硫酸盐还原与旱季相比 (图4f，橙色背景)在雨季(图4f，蓝色背景)具有较高的群落功能度(相对丰度5-10%)。此外，与2017-2018年雨季相比，2016-2017年雨季这些代谢能力有了更大的提高(图4f)，这可能反映了降雨的主要差异(2016-2017年比2017-2018年多25厘米雨量)。总的来说，我们发现Ag地下水是CPR和DPANN生物的高丰度和多样性的极其稳定的孵化器，但微生物群落在其代谢能力方面并没有停滞，这在雨季和干旱季节之间是不同的。

纤毛介导的超小细胞与宿主之间的附生共生相互作用

Pili-mediated episymbiotic interactions between ultrasmall cells
and hosts

了解CPR和DPANN在地下水群落中的更广泛作用的基础是描述它们与宿主的关系。除了少数例外，宿主生物尚未得到确切的鉴定，只有少数研究使用了高分辨率显微镜以直接观察CPR/DPANN与自然环境中宿主之间的物理关联。为了观察CPR/DPANN-宿主在Ag地下水群落中的相互作用，我们使用切向流动过滤技术(TFF)轻轻地从地下水中浓缩细胞，并通过冷冻法在原位将它们保存在液态乙烷中，以便以后用冷冻-TEM进行表征。

观察到许多超小细胞(最长尺寸<500nm)附着在较大的宿主细胞表面(图5a)。超小细胞有细胞包膜，由纤毛装饰(图5，白色箭头)，其中一些纤毛延伸到相应的宿主细胞中，潜在地介导外寄生体-宿主之间的相互作用(图5，白色虚线框)。在超小型细胞-宿主接触区域如图5e,h所示，宿主细胞包膜增厚，而外寄生体细胞包膜变薄。对于多对超小型细胞和宿主，在细胞界面观察到一条较高密度的线(图5d,e,i,橙色箭头)，这类似于以前在古细菌ARMAN(DPANN)细胞和它们的Thermoplasmatales宿主之间的紧密界面上观察到的。图5a中的宿主有多个超小细胞直接附着在其细胞包膜上，似乎在分裂过程中(图5b,e,f)，增加了CPR/DPANN复制与宿主附着相关的可能性(在下一节中讨论)。总之，TFF浓缩地下水的冷冻-TEM成像表明，Ag地下水中的一些超小细胞-根据大小可能是CPR或DPANN生物-是原核宿主的附生生物，通过纤毛状结构附着其上。

图 5 切向流过滤富集的Ag地下水细胞的成像

Imaging of Ag groundwater cells concentrated with tangential flow filtration

a,附着有多个超小细胞(在b和e中放大)的较大宿主细胞(白箭头)的图像;

b,对(白色方框)中指示区域的放大，显示附着到较大宿主细胞表面的超小细胞链;

c,b(黑色方框)中指示区域的放大，显示两个超小细胞和装饰其表面的纤毛状附属物(白色箭头)之间的接触区域;

d,放大b(白色方框)中的指示区域，显示超小细胞和宿主细胞之间的接触区域。纤毛状附属物由白色的箭头指示;

e,对(白色方框)中指示区域的放大，显示由连接到宿主的纤毛状附属物(白色箭头)装饰的单个超小细胞。附着可通过从超小细胞延伸到宿主细胞的纤毛状附属物(白色虚线框)介导;

f,g,e(黑色方框)中的超小细胞的膜，膜结构显示出明显的周期性，测量为10nm(f)，同时g中显示傅里叶空间中周期性明显为3.8nm(g；白色箭头表示重复结构间隔);

h,有一个单一的超小细胞附着的宿主细胞的图像。几个纤毛状附属物从超小细胞延伸到宿主细胞(白色虚线框和箭头);

i,j,在h(白色方框)中放大指示区域，显示宿主细胞包膜，其外层具有3.2nm的周期性，这里显示的是傅里叶变换图像(j；白色箭头表示重复结构间隔);

k,l,在h(白色方框)中放大指示区域，显示宿主细胞包膜，其外层具有3.2nm的周期性，这里显示的是傅里叶变换图像(j；白色箭头表示重复结构间隔);

对于d和e，橙色箭头表示在接触界面处观察到的高密度线。刻度尺，1μm(a)、200nm(b、e和h)和50nm(c、d、f、i和k)。

关于CPR细菌生物学的一个重要问题涉及其细胞包膜的性质及其与宿主细胞相似的程度。基因组分析表明，CPR细菌不能重新合成脂肪酸，但确实具有基于脂肪酸的膜脂，这增加了CPR细菌从宿主生物中接收脂质或脂质构建块的可能性。图5e中的超小细胞有一个表面层周期性为3.8nm和10nm，但缺乏革兰氏阴性菌的外膜(图5f,g)，这与以前地下水CPR细菌的低温TEM图像一致。同时，宿主的细胞包膜似乎有两个脂质层，表明其革兰氏阴性结构(图5d,e)。在图5h中，从不同的超小细胞-宿主对中，我们还解析了宿主细胞包膜中的两个脂质层，而超小细胞中没有外膜。有趣的是，在这种情况下，在两个宿主细胞的最外层都检测到3.2nm的周期性(图5i)和附着其上的超小细胞(图5k)，但目前尚不清楚两个细胞的外层是否具有相同的结构。在明显缺乏外膜的基础上，在Ag地下水中观察到的超小细胞具有不类似于革兰氏阴性细菌的细胞包膜，但似乎可以附着在革兰氏阴性宿主上。

宿主附着和CPR/DPANN细胞的复制

Host attachment and replication of CPR/DPANN cells

对可能直接附着在宿主细胞上的CPR/DPANN的成像使我们研究了广泛的物理附着是如何存在于跨越两种超级门的多样性情况下的。我们分析了CPR/DPANN生物在5个样点过滤孔径大小组分中的分布，这应该反映两个影响因素—细胞大小和对宿主细胞的附着度。CPR和DPANN以外的大多数微生物存在于0.65-2.5µm或2.5µm组分中(图4b)。由于它们的较小的细胞尺寸(平均~0.2µm直径)，存在于2.5µm或0.65-2.5µm的CPR/DPANN细胞可能附着在较大的生物体上，而存在于0.1-0.2µm组分中的CPR/DPANN细胞可能没有附着。在2.5µm和0.65-2.5µm组分中，CPR/DPANN基因组的大量覆盖表明，相当数量的CPR/DPANN细胞在整个过滤过程中保留了宿主附着，我们认为很可能纤毛从超中心细胞进入宿主(图5)，足够强以抵抗过滤过程中的破坏。因此，我们认为CPR/DPANN生物在过滤孔径大小组分的分布可以当做宿主附着程度的指示。

为了评估生物体在大小组分中的分布，我们从基因组的相对丰度和提取的DNA质量中估计每个基因组所代表的细胞的绝对数量。我们观察到在2.5µm和0.65-2.5µm的分数中，CPR和DPANN基因组的高细胞计数(>1028细胞)(图6a)，他们代表着不同范围的谱系。对于2017年3月和2017年9月的Ag样品，不同CPR和DPANN基因组的细胞计数在0.65-2.5µm分数比0.1-0.2µm高几个数量级(图6a)。这些细胞计数分布表明，宿主附着的生活方式在不同的CPR和DPANN谱系中以及整个地下水位中很常见。

图 6 CPR / DPANN生物的宿主附着和生长速率分析

Analysis of host attachment and growth rates of CPR/DPANN organisms

a，在本研究中收集的所有大小组分数据的估计细胞计数(对数转换)。所示的每个大小组分对应于单个采样事件。在某些位点进行尺寸过滤在运输是不可行的，而且收集到的一些过滤组分不含有足够的生物量进行DNA测序;

b，在Ag地下水连续组分过滤后，对最大(2.5µm)和最小(0.1~0.2µm)组分基因组的估计细胞计数进行two-sided paired t-test的结果。阳性的t统计结果表明，与0.1~0.2µm组分相比，2.5µm的细胞富集。上面列出的值是每个门级谱系的计算P值和样本大小(n，测试的基因组数量);

c，在所有Ag样本点上CPR细菌基因组在0.65-2.5µm分数与0.1-0.2µm分数之间的iRep计算结果。n=28(2017年3月)、=8(2017年9月)、=11(2018年2月)和=8(2018年6月)个基因组进行测试。需要注意的是iRep代表由基因组表示的细胞群体的平均复制状态。iRep为1.0表明平均在种群中没有一个细胞在活跃地复制，而iRep为2.0表明平均每个细胞都在活跃地创建其基因组的一个副本。对两个尺寸组分之间的iRep的two-sided paired t-test的统计学显著结果(P<0.05)如框图上方所示。需要注意的是2017年11月时间点被排除，因为只进行大量过滤(无尺寸过滤);

d，大量0.1µm过滤器(全群落过滤)中捕获的Ag细菌的iRep计算结果。在所有可能的采样点对之间的CPR细菌iRep的独立two-sided paired t-test统计学显著结果(P<0.05)如框图上方所示。对于框图，中心线为中值，顶部和底线分别为第一和第三四分之一；胡须显示四分之一范围的1.5×；单个点为异常值；图上显示了n值(测试的基因组数)。

对于大多数CPR和DPANN谱系，0.1-0.2µm分数的估计细胞计数明显高于2.5+µm分数，而其他细菌和古细菌谱系表现出相反趋势(paired t-test;图6b)。两个显著的例外是CPR谱系“Candidatus Kerfeldbacteria”和DPANN谱系“Candidatus Pacearchaeota”，相对于0.1-0.2µm组分2.5+µm组分更富集(paired t-test，P=0.027和0.021;图6b)，表明与其他CPR/DPANN谱系相比，这些种群其他CPR/DPANN谱系相比宿主附着组分更高和/或更能抵抗过滤的破坏性影响。Ca. Pacearchaeota基因组特别编码了DPANN谱系中最小的代谢能力(图3b)。这表明它们严重依赖宿主资源。另一个CPR谱系，“Candidatus Woesebacteria”，被发现在2.5+µm组分中的细胞计数明显高于0.2~0.65µm组分。

正在分裂的宿主上附着的超小细胞的低温EM图像(图5a,b)提示附着在宿主上可能刺激CPR/DPANN细胞的分裂。为了研究这一假设，我们计算了Ag地下水中CPR基因组的瞬时复制率(iRep值)(古细菌基因组被排除在外，因为古细菌复制通常不是双向的)。作为参考，iRep=1.0表明，平均而言，没有一个基因组代表的细胞正在积极复制，而iRep=2.0则表明，平均而言，每个由基因组代表的细胞都在创建其基因组的一个副本。我们发现，在三个Ag样本点—2017年3月、2018年2月和2017年6月—CPR在0.65-2.5µm组分中的复制率明显高于0.1-0.2µm组分(图6c)，表明宿主附着的CPR细菌始终表现出比非宿主附着的CPR细菌更高的复制率。我们发现，与2018年旱季(2018年6月，图6d)的高度相比，在2016-2017年雨季(2017年3月)和下一个雨季(2018年9月)开始期间，CPR细菌作为一个整体(在大量过滤群落中测量)表现出更高的复制率。在2017-18雨季(2018年2月；图6d)的任何点与高度之间没有观察到大量过滤复制率的显著差异。这可能是由于2016-2017年雨季的降雨量比2017-2018年雨季多25厘米的原因。这些发现共同支持了CPR细胞复制是由宿主附着刺激的，并且可能在雨季比旱季更普遍。

讨论

我们对北加利福尼亚的一个农业和七个原始地下水地点进行了取样，这些地点位于一系列岩石类型中，来源于多个含水层。我们总共回收了746个质量CPR和DPANN基因组，它们来自两个超门内的大多数主要谱系和CPR中两个明显新的门级谱系中，以下称为“Candidatus Genascibacteria”和“Candidatus Montesolbacteria’。据我们所知，只有两项先前的研究已经解析并比较了多个地下水位点的CPR细菌基因组，但这些都没有报告DPANN基因组。从本研究中恢复的基因组与以前对Crystal Geyser和Rifle含水层的研究之间存在很少的物种级重叠(定义为>95% ANI)，这一发现可能反映了物种适应地下水系统不同地球化学条件的组合瓶颈效应和/或创始人效应。我们的研究结果表明，使用0.1µm过滤器而不是0.22µm过滤器以及MAGs的分装来捕获最大的CPR/DPANN多样性，可以表征其他地下水位点的微生物群，这可能揭示出CPR和DPANN辐射的进一步多样性。。

我们取样的原始地点是当地饮用水的来源。值得注意的是，在取样时，一个多世纪以来一直是公共饮用水的来源的Pr2站点(Rattlesnake Spring)含有30%以上的CPR细菌和3%的DPANN古菌，增加了地下水中CPR/DPANN是人类相关成员的来源的可能性。在多个人体部位都可以检测到CPR细菌，它们与炎症性肠病、阴道病、牙周炎和疱疹病毒滴度3有关；同时在肺液中可以检测到DPANN古菌。然而，很少有人类相关CPR或DPANN的基因组存在，关于它们在人类微生物群中的作用及其与环境对应物的关系现在的研究信息很有限。最近的一项研究发现，人类相关和地下水Saccharibacteria之间的变异很小，线性度也很高，这表明饮用水可能是人口腔CPR细菌的来源。然而，所有这些与人类相关的Saccharibacteria基因组都来自使用自来水的人(尽管CPR细菌在处理后可以在饮用水中持续存在)，而不是直接以地下水作为饮用来源。为了调查地下水是否是人类相关CPR细菌的来源，有必要将地下水位置与使用地下水和自来水作为主要饮用水来源的特定人类的微生物群一起测序。

Ag地下水微生物群落，包括来自大多数CPR和DPANN谱系的生物体，在菌株水平上非常稳定(>99% ANI)。这种稳定性可能是由于在泻湖和草堆现场收集的用于给玉米田施肥的农业废物(牛粪)的碳和氮持续大量输入。虽然Ag群落组成稳定，但群落代谢能力的增加和CPR细菌复制率提升发生在雨季。导致雨季这些变化的一些因素可能是：地下水缺氧加剧，农业废料桩的径流增加，春季幼牛出生后牛肥微生物成分增加和变化，以及邻近玉米田的土壤变化，提供给Ag采样点大部分补给。随着时间的推移，对共丰度模式的分析表明，几种CPR谱系和Planctomycetes、Ignavibacteria 和 Betaproteobacteria宿主之间可能存在共生/互惠关系，尽管需要更多的研究才能直接将这些观察结果与共生关系联系起来。这些观察结果为基于有利于假定宿主生长的条件的CPR和DPANN的定向培养提供了一个起点。从Ag地下水中解析了不同的DPANN，但很少有非DPANN古细菌基因组，这提出了一个有趣的问题，即细菌是否可以作为DPANN古菌的宿主。

我们研究的一个重要方面是使用低温TEM技术，这项技术很少用于研究近原生的群落，以观察超小细胞和Ag地下水中宿主之间的物理附着。结合对CPR和DPANN细胞数量的基因组分析，我们的数据表明，在两种辐射中，对宿主生物的物理附着是一种常见的生活方式，相对于其他CPR和DPANN生物而言，CPR中的Ca.Kerfeldbacteria和DPANN中的Ca.Pacearchaeota表现出对宿主的特别强的物理附着性。根据复制率分析和宿主连接超小细胞的低温TEM成像显示正在进行的分裂，指示较高的CPR即时复制率与宿主的物理附着相关，这表明宿主提供的资源的可用性可能会刺激CPR生物体的复制。相反，最近的一项研究得出结论，由于未能检测到SAG中同时出现的CPR和宿主基因组特征，因此CPR细菌没有广泛附着于宿主。然而，我们认为报告的SAGs的不完整性和每个位点分析的生物的绝对数量很小，因此结果尚无定论。我们的研究强调，需要用高质量的MAG和高分辨率显微镜来以一种高鲁棒性的方式来评估群落成员之间的相互作用。

Reference

Christine He,Ray Keren,Michael L. Whittaker,Ibrahim F. Farag,Jennifer A. Doudna,Jamie H. D. Cate,Jillian F. Banfield.Jillian F. Banfield.Nature Microbiology volume 6, pages354–365(2021) https://doi.org/10.1038/s41564-020-00840-5

通讯作者简介

Jillian Fiona Banfield FRS FAA (born Armidale, Australia) is Professor at the University of California, Berkeley with appointments in the Earth Science, Ecosystem Science and Materials Science and Engineering departments. She leads the Microbial Research initiative within the Innovative Genomics Institute, is affiliated with Lawrence Berkeley National Laboratory and has a position at the University of Melbourne, Australia. Some of her most noted work includes publications on the structure and functioning of microbial communities and the nature, properties and reactivity (especially crystal growth) of nanomaterials.

Honors and awards

2018 Elected a Fellow of the Royal Society (FRS).

2017 V.M. Goldschmidt Award, Geochemical Society

2015 Elected to the Australian Academy of Science (International Member)

2015 Honor doctorate, Ben Gurion University, Israel

2013 Award of Dr. sch. h.c. ETH Zurich, Switzerland

2011 L’Oréal-UNESCO Awards for Women in Science: North American Laureate

2011 Benjamin Franklin Medal in Earth and Environmental Science of the Franklin Institute

2010 Dana Medal of the Mineralogical Society of America

2007 Elected Fellow, The Geochemical Society

2007 ASM Division Q Lecturer (Environmental and General Applied Microbiology)

2006 Elected Fellow, American Academy of Microbiology

2006 Elected to the National Academy of Sciences

2005 Pioneer Lecturer, Clay Minerals Society

2005 Rosenqvist Lecturer, Norway, May 2005

翻译：周之超 威斯康星大学麦迪逊分校(UW-Madison)

责编：马腾飞 南京农业大学

审核：刘永鑫 中国科学院遗传与发育生物学研究所

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