三合一技术：扩增子绝对定量测序=常规扩增子测序+总细菌绝对定量+特定菌种绝对定量

   引  言  

目前的细菌群落结构研究技术有：变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）、二代高通量测序技术（16S扩增子测序）等，而细菌定量研究技术有：qPCR法、平板培养计数法、显微镜计数法等。目前微生态研究中常常同时使用以上多项技术，最常用的组合莫过于qPCR绝对定量检测细菌总拷贝数及特定菌种拷贝数和常规微生物16S扩增子测序检测细菌群落结构的联合使用了。实际上如何将细菌群落结构和细菌绝对定量有机结合起来从而同时获得细菌群落结构和细菌菌种绝对拷贝数是目前微生物研究领域的一个技术趋势，同时对样本微生态的分析研究工作更具有重大意义，那目前微生态研究最常用的16S扩增子测序技术和qPCR技术分别存在哪些固有的技术痛点呢？下面我们就细细道来。

● 目前常规16S扩增子测序技术在微生物定量研究中的短板是什么？

常规16S扩增子测序技术虽然其具有高通量，低花费，可客观还原菌群结构及相对丰度比例的巨大优势，但是其是通过某一OTU分类单元的序列数所占总序列数的比值来获得某个细菌的相对丰度比例信息，然而相对丰度信息不能反映样本中物种真实的绝对丰度情况，因此通过此技术得到的结果说X菌在A组相对于B组增多是错误的，应该是X菌在A组中的丰度比例相对于B组增多。

● 目前qPCR技术在微生物定量研究中的短板是什么？

qPCR绝对定量技术是将已知拷贝数的标准品梯度进行稀释，进行qPCR检测，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，对样品进行目的基因qPCR检测，根据标准曲线就可以计算样品中物种的绝对拷贝数，虽然可以进行物种绝对定量分析，但是qPCR定量实验结果常常不稳定，且特定物种qPCR需要设计特定引物，对引物特异性要求较高，且引物优化难度较大，导致常规的qPCR绝对定量实验不再适用于组成较为复杂的环境样本微生物绝对定量。

基于上述原因天昊生物开发了高通量高精准度的微生物16S扩增子绝对定量测序技术，该技术是一种将qPCR绝对定量技术和常规16S扩增子测序技术合二为一的技术，该技术不但可以进行Alpha多样性分析、群落组成分析、Beta多样性分析和环境因子分析等常规扩增子测序分析，而且可以解析样本中总细菌的绝对拷贝数，还可以解析样本中绝大多数优势物种的绝对拷贝数，可以说一个实验搞定常规微生物扩增子测序和qPCR绝对定量检测，该技术充分发挥了“常规16S扩增子测序（细菌群落结构）+qPCR（细菌绝对拷贝数）” 两种检测技术的各自优势，变‘两张皮’为‘一盘棋’，简直就是“1+1＞2”，最大限度地便利了广大微生态研究者，下面就让我们仔细品味一下这个让人耳目一新的微生态检测新技术。

  正  文 

技术简介：

天昊生物16S扩增子绝对定量测序技术是通过向样品DNA中添加一定量spike-in DNA，进行16S扩增子文库构建、测序，再根据spike-in DNA的16S扩增子reads数及其绝对拷贝数绘制标准曲线，计算出样品中OTUs代表序列对应物种16S rRNA基因绝对拷贝数。添加spike-in DNA到样品模板中进行16S rRNA基因扩增子高通量测序较好的解决了样本中微生物的绝对定量问题，同时也能得到样本中的物种组成信息。

技术优势：

◆ 数据量大：不低于5万reads/样品，可检测环境微生物群落中的痕量菌，以及发现新的微生物。

◆ 性价比高：单个16S扩增子绝对定量测序可同时获得样本中微生物的组成信息和绝对定量数据。

◆ 适用范围广：可同时得到样本中绝大多数优势物种的绝对定量数据，该方法具有普遍适用性。

◆ 真实、准确：绝对定量数据，测序结果真实，客观还原菌群结构及丰度比例，无样品偏差可直接比较。

技术参数：

服务流程：

部分结果展示：

1)  样本OTU代表序列对应物种16S rRNA基因绝对拷贝数计算

a)   向样本DNA中添加Spike-in DNA，然后对样品DNA和spike-in DNA进行16S扩增子测序。

b)  使用Spike-in DNA的序列数，结合其绝对拷贝数，以log（copies）为横坐标，log（reads）为横坐标，绘制标准曲线：

图1  Y4样品的标准曲线

c)  标准曲线如下根据标准曲线计算的测试样品中优势OTU序列的起始拷贝数：

表1 根据标准曲线计算的测试样品中优势OTU序列(Top10)的起始拷贝数

d) 根据各样品内部的标准曲线计算出各样本物种绝对拷贝数情况：

图2 每个样品的绝对拷贝数情况（Top 20个OTUs）

Q&A

Q:

微生物16S扩增子绝对定量测序相对于qPCR绝对定量技术和常规扩增子测序技术有什么明显优势？

A:

微生物16S扩增子绝对定量测序是一种将qPCR绝对定量技术和常规扩增子测序技术合二为一的一种创新性技术，可以说微生物16S扩增子绝对定量测序=常规16S扩增子测序+总细菌qPCR绝对定量+特定菌种qPCR绝对定量，因此通过微生物16S扩增子绝对定量测序既可以解析样本中总细菌的绝对拷贝数；解析样本中特定物种的绝对拷贝数；也可以进行Alpha多样性分析、群落组成分析、Beta多样性分析和环境因子分析等常规扩增子测序分析内容。

Q:

微生物16S扩增子绝对定量测序技术和qPCR绝对定量技术全方位对比如何？

A:

准确度：我们比较qPCR绝对定量方法与16S扩增子绝对定量测序方法所测定的同一系列样本的细菌总拷贝数，Pearson相关性分析结果显示：两组数据在0.01水平上显著相关，相关系数为0.955，且两种方法计算的细菌总拷贝数值较为接近，未超过一个数量级，说明通过微生物16S扩增子绝对定量测序技术进行微生物绝对定量是可靠准确的。

稳定性：qPCR定量批次间及样品重复间（批次内）稳定性较差，而16S扩增子绝对定量测序目前的项目结果显示稳定性相对较好。

特异性：16S扩增子绝对定量测序所用的引物是常规16S扩增子测序最公认的引物，引物特异性很好，并且这一对引物就可以得到总细菌和所有菌种的绝对拷贝数；而特定菌种qPCR检测则需要设计特定的引物，对引物特异性要求较高。

灵敏度：qPCR理论检测灵敏度可以达到10¹分子，实际检测中，有效灵敏度取决于标准曲线的菌种丰度下限，受qPCR检测平台和实验方法的限制，通常检测下限在10²水平；16S扩增子绝对定量测序理论检测灵敏度为单分子，实际检测中，有效灵敏度取决于标准曲线的菌种丰度下限，与添加的spike-in总拷贝关联（添加10⁵拷贝：检测下限为10²拷贝，添加10⁶拷贝：检测下限为10³拷贝）。

Q:

spike-in的添加对样本原有群落组成和样本物种绝对丰度是否有影响？

A:

● 以下是比较样本A三次测序结果，三次测序编号分别为A_V4（未添加spike-in）、Y42_V4（添加10⁶ copies Spike-in）、Y4_V4（添加10⁷ copies Spike-in）。结果显示：Y4_V4、Y42_V4、A_V4样本优势菌属完全一致，且这些菌属在各个样本中的相对丰度比较一致，说明spike-in的添加对样本属水平的群落组成无明显影响。

图3 属水平群落组成柱状图

● 比较同一样本中添加不同比例spike-in DNA测得物种绝对拷贝数。结果发现添加17.4%和63.8% spike-in DNA对同一样本的物种16S绝对拷贝数的计算值比较一致，说明添加spike-in对样本中细菌进行绝对定量的方法重复性和稳定性均较好，能够真实定量出样本中各个物种的绝对丰度。

图4 优势OTU代表物种绝对拷贝数（Top10 )

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