基因岛遗传分化导致了盐生植物根系真菌黑色素合成的分子进化

Divergence of a genomic island leads to the evolution of melanization in a halophyte root fungus

The ISME Journal [IF:9.180]

DOI：https://doi.org/10.1038/s41396-021-01023-8

发表日期：2021-06-09

第一作者：Zhilin Yuan(袁志林)^1,2

通讯作者：Zhilin Yuan(袁志林)
(yuanzl@caf.ac.cn)^1,2 and Francis M. Martin(francis.martin@inrae.fr)^12,13

合作作者: Irina S. Druzhinina, John G. Gibbons, Zhenhui Zhong, Yves Van de Peer, Russell J. Rodriguez, Zhongjian Liu, Xinyu Wang, Huanshen Wei, Huanshen Wei, Jieyu Wang, Guohui Shi, Feng Cai(蔡枫), Long Peng

主要单位：

¹中国林业科学研究院树木遗传育种国家重点实验室(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Chinese Academy of Forestry, Beijing, China)

²中国林业科学研究院亚热带林业研究所(Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Hangzhou, China)

¹²北京林业大学(Beijing Advanced Innovation Center for Tree Breeding by Molecular Design, Beijing Forestry University, Beijing, China)

¹³法国洛林大学(Université de Lorraine, INRAE, UMR Interactions Arbres/MicroOrganismes, Centre INRAE Grand Est Nancy, Champenoux, France)

深色有隔内生真菌(dark septate endophytes, DSE)是一类普遍存在于树木(如针叶林、杨树等)和草本植物根系中的真菌类群，能提高植物生长和抗逆性(干旱和盐碱胁迫等)。尤其在极端环境下，DSE的丰度往往比菌根真菌还要高。因此DSE被公认为是根系真菌组(mycobiome)的重要成员。但DSE如何适应逆境以及与植物的共生机理尚未取得实质性突破。中国林业科学研究院亚热带林业研究所/林木遗传育种国家重点实验室袁志林研究员团队与法国农业科学院Francis Martin院士(亚林所客座教授)和南京农业大学Irina Druzhinina博士开展合作，系统研究了滩涂盐碱地DSE真菌的种群结构与功能。分离鉴定了一种新的DSE真菌Laburnicola rhizohalophila sp. nov—金链根际盐生霉；微生物群落高通量分析表明该新种是根际微生物组的核心成员。L. rhizohalophila能与杨树(毛白杨、NL-895杨等)建立共生关系，侵染后在根系皮层细胞形成密集的微菌核结构，并促进无性系幼苗根系发育、养分吸收和耐盐能力。进一步研究发现，L. rhizohalophila菌株表现出明显的表型和生理变异。该现象十分少见，因为分离培养获得的30个菌株均来自同一种植物的根系和同一个采样区域（样点之间距离<1km）。这种小尺度的种内变异模式表明L. rhizohalophila种群的演化生物学值得深入探索。为此，对其中一个菌株进行了PacBio和Illumina基因组精细组装，并对其余29个菌株进行了基因组重测序。基于SNP位点研究了种群的遗传结构，鉴定出3个明显的亚群，种群分化指数较高(Fst=0.563)且亚群之间基因流十分有限，表明种群已产生了明显的分化。通过Tajima’s D中性检验和选择性消除(selective sweep)分析，发现group 1基因组中的一个黑色素合成基因岛(genomic island，长度约20 Kb)受到了强烈的正向选择。进一步体外测试表明，在盐胁条件下group 1菌丝中积累的黑色素含量明显高于group 2，进一步支持了上述推断。DSEs在盐胁条件下合成更多的黑色素能否间接提高树木耐盐能力是目前正在探索的课题。

更有趣的是，PacBio和Illumina测序表明L. rhizohalophila一个亚群(group 3)的基因组大小(~121 M)是另外两个亚群(~64 M)的2倍左右。通过杂合SNP鉴定、细胞核DAPI染色以及基因组共线性分析，表明group 3是group 1和group 2杂交形成的异源二倍体，打破了自然界绝大多数丝状真菌是单倍体的传统认识。

图1 金链根际盐生霉种群的遗传结构

a L. rhizohalophila 分离株和外群物种 Letendraea helminthicola (CBS 884.85, Pleosporales, Ascomycota) 的系统发育关系。最大似然 (ML) 树是使用 1,241,238 个 SNPs 构建的。树群(或亚群)用红色、蓝色和紫色表示；

b 29 个单独的分离株的主成分分析 (PCA) 确定了三个不同的组。同一群体中的个体使用相同的符号进行标记。第一和第二主成分分别占总变异的 41.5% 和 17.4%；

c 增加聚类数量的 ADMIXTURE 图（K 设置为 2 到 4）。模拟设置为 1000 自展，并进行十倍交叉验证。每个个体由一个细的垂直条表示，该条被划分为 K 色段并代表每个簇的个体隶属关系。

图2 金链根际盐生霉种群重组模式分析

a SNPs对之间的连锁不平衡(LD)衰减，测量为R2，距离在同一支架(scaffold)上；

b L. rhizohalophila JP-R-44 的配对结构和组织表明其同种繁殖模式。sla2：细胞骨架组装控制蛋白，(蛋白质 ID 13068)；apn2：DNA 裂解酶(蛋白质 ID 13428)；cox13：细胞色素氧化酶(蛋白质 ID 13427)；apc5：氨基酸-多胺-有机阳离子(蛋白质 ID 13426)；

c 在 29 L. rhizohalophila 分离株的 SplitsTree 中生成的系统发育网络。比例尺表示遗传距离。分支长度表示成对距离(未校正的 p 距离)。

图3 29 个 L. rhizohalophila 个体的全基因组拷贝数变异概况

a 概述了L. rhizohalophila群体间具有高度分化拷贝数的包含盐度响应和黑色素生物合成基因的位点；

b,c,d 绘制了在所有contigs(x 轴)上使用10-kbp 重叠滑窗计算的 PIC 和 Vst 值(y 轴)。水平红线表示 Vst 值为 1。

图4 金链根际盐生霉种群的遗传分化和正向选择信号的检测

a 绘制组1和组2之间的重叠群 Z 转换固定指数 ZFst 的全基因组分布。支架按照参照基因组排列在x轴上，按颜色分开。每个 10-kbp 窗口内的基因被绘制在一个列中，并标记了 95% 和 99% 的异常值；

b 支架6中分化的基因组岛扩大(包含6个基因)，其中检测到组1中强的正向选择信号。突出显示第 1 组中显示高 Fst、低核苷酸多样性 (θπ)、负Tajima D 和高 CLR 值的基因组区域；

c，d Haploview v4.1 绘制的 pks2 和 mfs 基因的 LD 分析。LD
图上方的数字和矩形代表相应外显子的位置。该图的颜色对应于站点之间 LD 的强度，蓝色代表强 LD，黄色代表弱或无 LD。带有黑色粗线的三角形表示 LD 块。

图5 在盐胁条件下金链根际盐生霉两个亚群菌落直径、生物量和黑色素含量的差异分析

来自第 1 组和第 2 组的代表性分离株的黑色素合成和菌丝体生长。对于菌落直径和生物量的测量，使用 2% 和 6% 的NaCl 水平。

a 盐胁迫条件下两组生物量比较；

b 添加 2% 和 6% NaCl 的 PDA 平板上的生长速率；

c 2% NaCl与无NaCl下两组黑色素生成情况比较。数据是来自实验的四个生物学重复的平均值。误差棒代表标准偏差。学生 t
检验用于确定两组之间的显著差异。对于每个比较，显示了 p 值。

图6 正向选择对金链根际盐生霉黑色素合成基因簇的作用机制示意图

示意图概述了正选择对金链根际盐生霉 中黑色素生物合成基因簇的潜在影响。PKS2催化黑色素生物合成的第一步；

黑色素生物合成抑制剂(三环唑和曲酸，50 μg mL-1)的使用证实，金链根际盐生霉 合成了二羟基萘黑色素(DHN-黑色素)，作为在曲酸存在下生长的菌落，曲酸是二羟基苯丙氨酸(DOPA)黑色素的抑制剂，看起来正常并且与对照没有区别。图中显示了组1和组2的代表性分离菌株在25°C无NaCl的PDA上生长2周的情况。作用于这个基因组岛的正向选择导致许多有益的非同义突变的固定。使用 antiSMASH5.0，在计算机上预测了簇组织(六个基因)和 PKS2 域，包括KS、AT、ACP 和 TD。显示了涉及黑色素生物合成（PKS2 和 MSHR）、膜运输 (MFS)、调节（两个转录因子）、定位和沉积（由扩展蛋白调节的细胞壁松散）的黑色素代谢模型。PKS 聚酮合酶、MSHR 促黑素细胞激素受体、MFS 主要促进剂超家族、TF 转录因子、EXP 扩展蛋白、THN 四羟基萘。

研究成果为破解DSE真菌调控树木环境适应性机制提供了有力的遗传学工具；表明L. rhizohalophila 可能产生了黑色素化和基因组多倍化等两种适应性机制来应对盐渍化土壤的胁迫，为解构树木-土壤真菌共生的逆境演化生物学提供理想模型和独特视角。此外，种内杂交形成的异源二倍体可能还具有杂合优势，为创制新型功能菌剂提升苗木抗性提供理论和技术依据。

福建农林大学刘仲健教授和钟阵晖博士、马萨诸塞大学Gibbons博士和华盛顿大学Rodriguez博士为本研究提供重要帮助。

Reference

Zhilin Yuan,Irina S. Druzhinina, John G. Gibbons, Zhenhui Zhong, Yves Van de Peer, Russell J. Rodriguez, Zhongjian Liu, Xinyu Wang, Huanshen Wei, Huanshen Wei, Jieyu Wang, Guohui Shi, Feng Cai(蔡枫), Long Peng, Francis M. Martin.Divergence of a genomic island leads to the evolution of melanization in a halophyte root fungus. ISME J (2021). https://doi.org/10.1038/s41396-021-01023-8

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