肠道微生物谱的改变与孤独症谱系障碍的神经递质代谢活动相关

Altered gut microbial profile is associated with abnormal metabolism activity of Autism Spectrum Disorder

Gut Microbes [7.823]

原文链接：https://doi.org/10.1080/19490976.2020.1747329

第一作者：但舟 毛旭华 刘歧莎

通讯作者：刘星吟 教授 (xingyinliu@njmu.edu.cn)

主要单位：南京医科大学基础医学院，生殖医学国家重点实验室，孤独症研究中心；江苏现代病原生物学重点实验室，南京医科大学整合肠病学重点实验室；江苏大学附属宜兴医院

标题：肠道微生物谱的改变与孤独症谱系障碍的异常代谢活动相关

关键词：孤独症谱系障碍（ASD）、肠道菌群、16S rRNA、宏基因组学、代谢组学、神经递质

导读

1. 孤独症组（ASD）的α多样性系数随着年龄的增加无显著的变化，而健康组（TD）的α多样性系数同年龄呈正相关，暗示孤独症患者肠道菌群发育处于相对停滞的状态。

2. 便秘孤独症患者组（C-ASD）的物种多样性降低，源于Sutterella、Prevotella 和Bacteroide 及同代谢活动紊乱相关的菌群减少，表明这些菌群可能参与便秘孤独症患者的致病机制。

3. 差异代谢物参与多种神经递质的代谢，如血清素、多巴胺、组氨酸和γ-氨基丁酸。

4. 差异代谢物与特定物种丰度变化相关。

背景

Introduction

孤独症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder，ASD）是一种广泛性的发育发展障碍，其病症主要包括异常的行为如社交障碍、刻板动作和狭窄兴趣，其中孤独症（又称自闭症）为最常见最严重的一种。孤独症的发病率在过去十几年里呈上升趋势，美国儿童患孤独症的概率为1:59，近几年，我国孤独症发病率也逐年攀升，并且在神经类残疾的疾病中位列第一。

多项研究表明胃肠道功能障碍如胀气、腹泻及便秘，在孤独症患者中较为常见。同时新近研究表明肠道菌群可通过“肠-脑”轴调节胃肠道生理、免疫功能，甚至行为。因此，有必要深入探讨不同年龄结构的孤独症患者的肠道菌群组成及差异。

前期一些小样本的队列研究发现孤独症患者拥有不同的肠道微生物结构，同时早期肠道菌群的组成会影响神经系统的发育，可能导致潜在不良的精神健康和智力活动。此外，一项临床研究发现孤独症患者的异常行为同患者年龄和胃肠道症状相关，因此有必要完善孤独症患者胃肠道功能异常的临床诊疗方法。

慢性便秘是孤独症患者常见的胃肠道症状，同时孤独症患者的便秘症状同急诊室就诊、住院次数正相关。因此，有必要深入研究孤独症患者的肠道菌群组成、菌群代谢物同胃肠道症状之间的潜在关系。

为了进一步探讨孤独症患者的肠道菌群结构同年龄和代谢之间的关系，以研发出更多诊疗孤独症的方法，本研究利用16S rRNA基因测序技术用于评估143例（2-13岁）队列研究的不同年龄阶段的微生物群落，同时利用宏基因组学分析30名便秘孤独症患者和30名健康者的肠道菌群组成，以探讨差异物种同差异代谢物如脂肪酸、氨基酸和神经递质之间的关系，为孤独症的诊疗提供基于肠道菌群的辅助诊疗方案。

结果

研究队列信息

Information of cohort children

本研究采用队列研究，研究者于2016年5月至2017年8月共招募143名已确诊的孤独症儿童（平均年龄4.937±0.155，男女性别为130:13），命名为ASD组；同时招募了143名队列健康儿童（平均年龄5.189±0.170，男女性别为127:16），命名为TD组。其中143名孤独症儿童中有52名具有便秘症状，5名具有腹泻症状（表1）。

表1. 入组研究对象情况表

Table 1. Characteristics of study participants

16S rRNA基因测序结果表明孤独症儿童的肠道菌群组成发生改变

Alterations of gut microbiota composition in ASD children based on the 16S rRNA data

根据286个样本的16S rRNA数据的队列分析，结果表明TD组的OTU数目多于ASD组（图1A）。α多样性指数分析表明在门水平上ASD组的丰富度估计量指数显著低于TD组，而属水平上无显著差异（图1B-1C），同时TD组与ASD组的菌群组成存在显著差异（图1D）。在门水平上ASD组的厚壁菌门丰度高于TD组，且厚壁菌门与拟杆菌门比值显著高于TD组（图1E）。基于LDA的LEfSe分析发现ASD组的变形菌门Proteobacteria和放线菌门Actinobacteria的相对丰度显著高于TD组，而拟杆菌门Bacteroidetes显著降低（图1F）。在属水平上，ASD组的Dialister、Escherichia-Shigella 和Bifidobacterium 丰度较高，而TD组的Prevotella 9、Megamonas 和Ruminococcus 2丰度较高（图1G）。

最近的研究发现儿童神经元发育与肠道菌群相关[1]，因此研究者进一步评估了不同年龄组的菌群多样性变化。研究者利用三种多样性指数（丰富度估计量指数、香农指数和系统发育多样性指数）评估组内年龄相关的α多样性指数。相对于TD组内的2-3岁亚组，TD组内的7-11岁亚组的α多样性显著增加；而ASD组内的α多样性均无显著变化，结果表明孤独者儿童的肠道菌群发育呈现严重的滞后状态（图1H-1J）。此外，研究者分析了门和属水平年龄相关的菌群丰度变化（图1K）。在门水平上，TD组的拟杆菌门同年龄呈负相关，而ASD组却始终保持在低水平；同时Firmicutes和Cyanobacteria在TD组随着年龄而增加，而ASD组随着年龄增加呈现异常变化。在属水平上，Lachnospira 和Megamonas 在TD组内的2-3岁和7-11岁亚组中丰度较高，而ASD组不存在此趋势；Bacteroides 在TD组内丰度同年龄负相关，而在ASD组中始终处于低丰度水平。这些结果进一步表明孤独症儿童神经元的发育可能与特定菌群丰度动态变化的异常相关[2]。

图1. 16S rRNA测序结果表明健康儿童组（TD）和孤独症儿童组（ASD）的肠道菌群组成存在差异

Figure 1. The shift of gut microbiota in typically developing (TD) and ASD children according to the 16S rRNA data

（A）OTU数目。（B-C）门水平（B）和属水平（C）的丰富度估计量指数分析。（D）基于unweighted UniFranc距离的PCoA分析（ANOSIM，R=0.1645，P = 0.001）。（E）厚壁菌门/拟杆菌门比值。（F）两组差异菌群的LDA评分。（G）LEfSe分析差异菌群，红色节点表示在ASD组富集，绿色节点表示在TD组富集。（H-J）基于年龄梯度的α多样性系数分析，包括丰富度估计量指数（H）、香农指数（I）和系统发育多样性指数（1J）。（K-L）基于年龄梯度在门水平（K）和属水平（L）的丰度热图（秩和检验， FDR < 0.05， FDR < 0.01，* FDR < 0.001）。

多项研究表明孤独症儿童存在肠道问题如腹痛、腹泻和便秘等。研究者的问卷调查结果也表明近40%孤独症儿童的肠道存在便秘症状。为了排除便秘症状对肠道菌群的影响，研究者利用非便秘孤独症组（NC-ASD）和TD组进行16S rRNA基因测序分析。结果表明NC-ASD组的OTU数目（图S1A）和α多样性指数均减少（图S1B-S1C），β多样性存在显著差异（图S1D-S1E）。同时，菌群组成也存在差异，相对于TD组而言NC-ASD组和ASD组中的Escherichia-Shigell 和norank_f__Lachnospiraceae 均显著升高，而Parabacteroides、[Eubacterium]_eligens_group、Megamonas 和Phascolarctobacterium 均显著降低（图S1D-S1F）。这些差异菌群在TD组和ASD组中也呈现相同变化趋势，因此便秘因素可能直接与孤独症的致病机制相关。同TD组相比，在ASD组中有8个差异菌属显著减少，如Dialister、Parasutterella、Christensenellaceae_R-7_group、Coprococcus_2和Collinsella，但是这些菌在NC-ASD组和TD组中均无显著差异，这暗示着便秘可能促进孤独症儿童的肠道菌群的异质性发展。

图S1. 非便秘孤独症组（NC-ASD）和健康组（TD）的肠道菌群分析。

Figure S1. Gut microbiota analysis between non-constipation of ASD (NC-ASD) and aged-match typically developing (TD)

（A）OTU数目。（B）丰富度估计量指数分析。（C）系统发育多样性指数分析。（D-E）基于Bray-curtis和unweighted UniFrac的PCoA分析。（F）前30个差异属的丰度热图

为了确定哪些菌群同孤独症儿童的便秘症状相关，研究者进一步对便秘孤独症儿童组（C-ASD）和非便秘孤独症儿童组（NC-ASD）进行16S rRNA基因测序数据开展队列分析。结果表明两组的OTU数目接近（图S2A）；同时C-ASD组的α多样性系数显著增加（图S2B-S2C）；两组的群落结构呈现显著差异（图S2D-S2E），如Lachnospiraceae_NK4A136、Subdoligranulum、Ruminococcus、Barnesiella、Butyricicoccus 和Ruminiclostridium 在NC-ASD组中的相对丰度低于C-ASD组，而Fusobacterium、Acidaminococcus 和Veillonella 的相对丰度则高于C-ASD组（图S2F）。因此，该结果表明差异属菌群可能参与孤独症患者胃肠道症状的致病机制。

图S2. 便秘孤独症组（C-ASD）和非便秘孤独症组（NC-ASD）的肠道菌群分析。

Figure S2. Gut microbiota analysis between non-constipation of ASD (NC-ASD) and constipation ASD (C-ASD)

（A）OTU数目。（B）丰富度估计量指数分析。（C）系统发育多样性指数分析 （D-E）基于Bray-curtis和unweighted UniFrac的PCoA分析。（F）前30个差异属的丰度热图。

人类肠道内复杂的微生物生态系统受到不同微生物群体的影响[3]。为了探讨肠道微生物群落潜在的共生关系，研究者分析了TD组和ASD组的生态网络系统，研究发现TD组的属水平菌群形成了一个相对简单的生态网络系统（图2A），而ASD组呈现了一个在属水平上共生和拮抗关系都更为复杂的生态网络系统（图2B）。因此，以上的分析进一步提示了孤独症儿童的肠道微生态系统紊乱。

基于肠道菌群的孤独症疾病预测

Gut microbiota–based prediction of ASD

为了筛选出可作为诊断孤独症的菌群标记物，研究者基于差异菌属（相对丰度>0且存在于95%的TD组或ASD组中）利用随机森林模型，鉴别出24个属（图2C-2D）可用于预测孤独症。

图2. TD组和ASD组的属水平肠道菌群结构存在显著差异

Figure 2. Genera strikingly different across TD and ASD children

（A-B）TD组（A）和ASD组（B）在属水平上的共生网络分析。每个节点代表一个属，节点大小为每个属在组内的相对丰度，线的粗细为Spearman相关系数，红线为正相关，绿线为负相关。（C）基于属水平，利用R随机森林模型评估属的鉴别性能，交叉验证模型根据预测因子数目和重要性进行排序。（D）最具鉴别性的24个属。水平条形图的长度代表变量（每个属菌群）的重要性。颜色代表富集与TD（绿色）或者ASD（红色）。（E）ROC曲线，AUC（曲线下面积）

宏基因组学揭示了便秘孤独症儿童和正常儿童在种水平上的肠道菌群结构存在显著差异

Metagenomic sequencing revealed significant differences between Constipated ASD group and TD group

为了进一步的探讨孤独症与胃肠道症状之间的潜在相互关系，揭示==孤独症患者肠道菌群的基因功能及其关联的代谢通路是与胃肠道症状是否存在联系==，研究者利用宏基因组学技术对30名健康儿童（TD）和30名便秘孤独症儿童（C-ASD）进行队列分析。结果表明两组的基因数目存在差异（图3A），物种丰富度估计量指数和香农指数均表明C-ASD组的α多样性显著降低（图3B-3C），群落结构也存在显著差异（图3D）。秩和检验表明C-ASD组的Bacteroides stercoris、Bacteroides plebeius 和Bacteroides plebeius CAG:211 的相对丰度显著低于TD组（图3E）。有趣地是，相对丰度最高的前20个差异物种均在C-ASD组中显著减少（图3F），其中包括Bacteroides 的9个物种，Prevotella 的4个物种，Phascolarctobacterium 的2个物种和Paraprevotella xylaniphila。因此，这些差异物种可能参与C-ASD患者的异常胃肠道症状的发生发展。同时研究者利用Netshift方法筛选出Ruminococcus lactaris 可能作为潜在的驱动C-ASD发展的关键差异物种（图3G）。

图3. 宏基因组学数据表明TD组和便秘ASD组（C-ASD）的肠道微生物组成存在差异

Figure 3. The gut microbiota divergence in ASD with constipation (C-ASD) and TD children based on the Metagenomic sequencing data

（A）微生物的基因数目。（B-C）种水平的α-多样性指数，包括丰富度估计量指数（B），香农指数（C）。（D）基于Euclidean距离的PCoA分析（ANOSIM，R=0.2262，P = 0.001）。（3E）前35个物种的丰度热图。（3F）前20个差异物种的丰度热图。箱线图内部的横线为中位线， FDR < 0.05，* FDR < 0.01，秩和检验。（3G）利用NetShift网络工具捕获TD组和C-ASD组两个共现网络中种水平的结构变化。普通的节点在圆的外围，所有的节点随机分配不同的颜色，节点大小显示预测的“驱动微生物”得分，得分大的红色节点是特别重要的“驱动微生物”；绿色连接线仅出现在TD组，蓝色连接线仅出现在ASD组，红色连接线同时出现在TD组和ASD组。

宏基因组学的功能分析揭示便秘孤独症儿童的肠道功能的受损

Functional analysis of Metagenomic sequencing revealed disrupted bacteria functions in constipated ASD group

宏基因组学可提供微生物相关的基因功能分析。研究者共预测了1550192个微生物基因，ANOSIM分析表明在 KO（KEGG orthologous）水平上TD组和C-ASD组的功能存在显著差异（图4A），基因功能组成也存在显著差异（图4B）；相对于TD组，ASD组基于level1、level2和ko水平的所有KEGG通路功能发生变化，如能量、脂质、维生素、聚糖和核酸等代谢通路呈降低趋势（图4C-4E）。同时其他的代谢功能如eggNOG，CAZy和ARGs也呈现异常，这些结果为揭示便秘孤独症患者的肠道功能紊乱的提供了有价值的分子基础。

图 4 基于KEGG数据库对TD组和ASD组的菌群基因功能进行注释

Figure 4. Microbial gene functions annotation on KEGG in ASD with constipation (C-ASD) and TD children

（A）基于KO水平的差异性分析。（B）基于Bray-curtis的PCoA。（C-D）基于level 1和level 2的KEGG通路的聚类分析。（E）基于KEGG功能的LDA分析评估两组间差异的代谢通路。

代谢组学分析揭示了孤独症儿童异常的代谢模式

Metabolomics analysis revealed aberrant metabolic patterns in ASD children

研究表明肠道菌群的代谢产物可进入血液，进一步调控宿主行为及生理活动[2, 4, 5]。因此，研究者采用非靶向代谢组学技术对TD组和C-ASD组进行代谢组学分析并探讨其代谢物间的相互作用关系。结果表明TD组和C-ASD组的代谢物组成存在显著差异（图5A-5D），同时17个KEGG通路也存在差异，主要表现为全局代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢（图5E）。其有37个差异代谢物具有2倍的差异，如C-ASD组中的己酸、chloroneb、DL-8-氨基辛酸的相对丰度较高（图5F）。研究报道氨基酸的中间代谢产物如谷氨酸的2,5-双氧戊酸酯（2,5-dioxopentanoate）和酪氨酸的去氨基酪氨酸（desaminotyrosine）在孤独症儿童中含量增加[6, 7]。在本研究中，研究者发现吲哚乙醛（indoleacetaldehyde）和吲哚-3-羧酸（indole-3-carboxylic acid）参与吲哚代谢，它们在两组中均呈显著差异。为了研究肠道微生物与代谢产物的关系，研究者利用Spearman相关分析发现相对丰度高的物种如Ruminococcus lactaris、Alistipes spp.、Oscillibacter sp. ER4 和Faecalibacterium sp. CAG:74 与代谢产物dihydrojasmonic acid、butanone、hexanoic acid、flunitrazepam、fospropofol 和caprolactone 正相关（图5G）。

图5. 便秘孤独症患者组（C-ASD）和健康组（TD）的肠道菌群存在异常的代谢模式

Figure 5. Aberrant metabolic patterns in ASD with constipation (C-ASD) and typically developing (TD) children

（A， B， C， D） 分别基于正向（ES＋）和负向（ES﹣）的PLS-DA 和 OPLS-DA的PCoA聚类分析。（E）17个差异显著的KEGG代谢通路。（F）37个差异显著代谢产物的丰度热图。（G）差异代谢产物和前45个物种的关联分析，选取Fold change≥2，P<0.05（T 检验）的差异代谢产物分析， 绿色负相关，红色正相关。+ 0.05 < P < 0.1， P < 0.05，* P < 0.01，T-test。

多项证据表明孤独症儿童的神经递质如血清素、多巴胺、GABA和吲哚等表达异常[8, 9]。最近的研究发现肠道菌群参与神经递质的合成及代谢，因此研究者进一步分析这些差异代谢物是否与神经递质的代谢相关。结果表明多种代谢物如Dopaquinone、Pyroglutamic acid、N-Carboxyethyl-g-aminobutyric acid、3-Indoxyl-D-Glucopyranoside、Indole-3-carboxylic acid、Valyl-Aspartate、和Caffeoyl aspartic acid参与多种神经递质的代谢，如血清素、多巴胺、组氨酸和γ-氨基丁酸，同时四氢生物蝶呤（Tetrahydrobiopterin，BH4）的代谢物水平在ASD儿童中表达异常。基于以上的研究结果均揭示肠道菌群参与神经递质的合成和代谢途径。

图6. 便秘孤独症组（C-ASD）和健康组（TD）差异代谢物富集的KEGG通路

Figure 6. KEGG pathway of the differential metabolites between C-ASD and TD group (Fold change > 1.25, VIP ≥ 1, P < 0.05 T test)

图7. 孤独症儿童（ASD）和健康儿童（TD ）肠道菌群组成和代谢分析的概要总结

Figure 7. The summary of gut microbiota composition and metabolism analysis between ASD and TD

结论

本研究揭示了孤独症患者的肠道菌群在门、属和种水平上和健康儿童的菌群结构及其代谢的差异。相对于TD组而言，ASD组的肠道菌群组成发生了变化。在ASD组中，Prevotella 和Megamonas 相对丰度降低，而Escherichia-Shigella、Dialister 和Bifidobacterium 增加。本研究发现ASD组不同年龄阶段儿童的肠道菌群组成与TD组存在差异，ASD组随着年龄的增加，其α多样性没有变化，而TD组α多样性随着年龄增长而增加，这提示ASD组的菌群发育可能处于相对停滞的状态。同时便秘ASD组（C-ASD）比非便秘ASD组（NC-ASD）的α多样性增加，该结果提示便秘可能增加孤独症患者体内肠道菌群的异质性特征。随机森林预测模型可高度鉴别ASD组和TD组肠道菌群差异，这为将肠道菌群作为诊疗ASD提供了可能性。同时ASD组的代谢产物异常，主要表现为脂肪酸、核酸和氨基酸代谢相关，并发现部分肠道菌群的代谢物参与了神经递质的代谢途径，这些结果为进一步从肠-微生物-脑轴揭示自闭症的病理机制奠定了基础。未来通过进一步动物实验验证后，发展针对与神经递质代谢相关的特定微生物群的干预可能是诊疗孤独症的一个辅助方案。

通讯作者简介

刘星吟教授，南京医科大学特聘教授，博士生导师。2006年获中山大学理学博士学位，2006年~2010年，先后美国罗切斯特大学(University of Rochester)和爱因斯坦医学院从事肠道微生物和表观遗传学研究。2015年10月受聘于南京医科大学基础医学院。并担任南京医科大学肠道微生态创新团队组长。先后入选江苏特聘教授，江苏特聘医学专家。主要从事肠道微生物与人类疾病关联的研究。近五年，以通讯作者或第一作者在包括Cell Host & Microbe, Cell Reports、PLOS Genetics、Gut Microbes 等国际权威期刊发表多篇创新性科研论文。

参考文献

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7. McClintock, M.K., J. Wang, and K. Zhang, Application of Nonphosphorylative Metabolism as an Alternative for Utilization of Lignocellulosic Biomass. Front Microbiol, 2017. 8: p. 2310.

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9. Strandwitz, P., Neurotransmitter modulation by the gut microbiota. Brain Res, 2018. 1693(Pt B): p. 128-133.

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