【文献阅读2】Cytological and transcriptome analyses reveal abrupt gene expression for meiosis and sacchari

Cytological and transcriptome analyses reveal abrupt gene expression for meiosis and saccharide metabolisms that associated with pollen abortion in autotetraploid rice.pdf
分子遗传学和基因组学（2018年）
细胞学和转录组分析显示同源四倍体水稻花粉败育与减数分裂和糖代谢的突然基因表达
摘要：
同源四倍体水稻是一种有用的种质，具有四个染色体组和强大的生物学优势;然而，低生育率限制了其商业利用。关于同源四倍体水稻低生育力的DNA变异和差异基因表达的信息很少。在本研究中，通过全基因组重新测序，与E249（二倍体对应物）相比，在T449（具有低生育力的同源四倍体水稻品系）中鉴定了81个SNP和182个InDel。我们仅检测到三个非同义SNP和六个大效InDel，它们分别与三个和六个基因相关。在减数分裂阶段通过转录组分析共检测到75种减数分裂相关的差异表达基因，包括对减数分裂DSB形成必不可少的OsMTOPVIB，以及参与同源染色体配对和突触的OsMOF。在T449中观察到中期I大约20.69％的滞后染色体和4.65％的异常四分体。此外，转录组分析显示在单个小孢子阶段T449中蔗糖转运蛋白（OsSUT5）和两个单糖转运蛋白（OsMST1和OsMST8）的下调，并且通过qRT-PCR验证它们的表达水平。糖分布的细胞学观察显示T449中糖的异常积累，并且在单个小孢子期，T449中的果糖和葡萄糖含量显着高于E249。我们的研究结果表明，多倍体不仅诱导减数分裂相关基因的突然表达变化，导致染色体行为异常，而且还引起糖相关基因的糖分布和表达模式的变化，这共同导致同源四倍体水稻的不育。
关键词：
同源四倍体水稻·花粉发育·碳水化合物代谢·糖类转运蛋白·减数分裂
介绍：
全基因组复制（WGD）或多倍体在植物进化中发挥了重要作用。由于基因表达模式的变化和遗传变异的增加，环境变化或压力增加了多倍体的短期适应性潜力（Wendel 2000; Soltis等人2009; Van de Peer等人2017）。植物中有两种主要类型的多倍体：异源多倍体和同源多倍体。异源多倍体起源于不同物种的染色体组的重复，这是植物进化的主要途径，可能具有生存优势，因为不同的染色体组是新环境中适应性成功的关键决定因素（Soltis等人2009; Paun等人） .2011; Van de Peer等人，2017）。自体多倍体涉及物种内的全基因组重复，这比单独的分类学更为普遍，并且已经成为植物多样性的重要元素（Soltis等人2007; Van de Peer等人2017）。多倍体物种广泛存在于植物中，并且比其祖细胞具有更高的经济和抗性重要性（Gebhardt和Valkonen 2001; Barker等人2016; Van de Peer等人2017）。同源四倍体水稻比二倍体水稻具有强大的生物学优势，例如巨大的营养器官，高产潜力和广泛的适应性（Shahid等，2011，2012; Tu等，2014; Yang等，2014）。然而，低生育力是同源四倍体水稻利用的主要障碍（He等，2011a; Shahid等，2013a; Wu等，2015; Li等，2017）。为了提高同源四倍体水稻的育性和产量，研究该生物体中的花粉发育及其分子机制至关重要。
部分花粉不育是同源四倍体水稻低育性的主要原因（Shahid等，2010; Li等，2016）。先前的研究表明异常染色体行为和异常微管组织是同源四倍体水稻花粉败育的主要原因（He等，2011a，b; Wu等，2014）。转录组分析表明，多倍体增强了花粉不育基因座的多等位基因相互作用，并增加了同源四倍体水稻的染色体异常（Wu等，2015）。此外，小RNA测序表明，花粉和胚囊的部分不育性是由同源四倍体水稻中特异性差异表达的miRNA引起的（Li等，2016,2017）。开发了多倍体水稻的两个光周期和热敏核不育系（PS006和PS012），它们的杂种表现出很大的杂种优势，并且提高了水稻品质和生产力的巨大潜力（Zhang et al.2017）。
新一代测序广泛用于基因组测序，转录组测序，小RNA测序，染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）和DNA甲基化测序。基因组重组技术是检测遗传变异的有效方法（Han和Huang 2013），其在QTL作图，标记辅助基因组选择和单倍体类型分析中起重要作用（McCouch等人，2010）。全基因组关联研究（GWAS）主要集中在使用全基因组重测序分析与抽穗期和谷粒相关性状相关的基因（Huang等，2012）。傅等人。（2016）在两个籼稻中鉴定了许多SNP和InDels
（RGD-7S和Tai Feng B）通过对两个水稻品种进行重新测序获得DNA多态性标记。 RNA转录技术（RNA-seq）是了解差异表达基因和植物中阶段特异性基因表达模式的有用工具。 RNA-seq已应用于检测二倍体水稻中非生物胁迫下的差异表达基因（Jin等人2013; Fu等人2017）。此外，与花粉发育过程中的二倍体水稻相比，RNAseq也被用于鉴定同源四倍体水稻中的差异表达基因（Wu等人，2014）。郭等人。（2017）通过RNA-seq在新四倍体水稻杂种中检测到许多与育性和杂种优势相关的基因。然而，与二倍体水稻相比，同源四倍体中几乎没有关于全基因组DNA变异与RNA-seq结合的信息。检测同源四倍体水稻品系（T449）与其二倍体水稻（E249）之间的基因组变异，这是一个着名的二倍体水稻品种，在Sa和Sb花粉不育基因座上含有双中性基因，S5n基因可以克服籼粳杂种使用高分辨率技术对无菌性（Shahid等人，2013b）进行重新测序。在我们的实验室中，T449已超过25代自交，并具有稳定的农艺性状。此外，染色体行为和组织学观察用于研究T449和E249中的花粉发育。在减数分裂和单个小孢子阶段期间还进行花药发育的转录组分析以检测T449和E249之间的差异表达基因（DEG）。本研究计划（1）观察花粉发育过程中同源四倍体水稻的染色体行为和糖分布，以及（2）检测可能与同源四倍体水稻低花粉育性相关的基因。我们发现减数分裂和糖相关基因的表达模式的突然变化导致同源四倍体水稻的低生育力。
材料和方法：
水稻材料：
在该研究中使用同源四倍体水稻品系（T449）及其二倍体对应物（E249）。 T449是从E249开发的，通过秋水仙碱处理，并在我们的农场进行了超过25代的自交。所有材料均在自然条件下在华南农业大学（SCAU）实验农场种植，管理实践遵循该地区的建议。
观察染色体行为和花粉育性
根据Wu等人观察到染色体行为。（2014）。从水稻植株的枝条中收获T449和E249的小穗，它们的旗叶垫和倒数第二个叶垫之间的距离为2至4厘米，并固定在Carnoy溶液（乙醇：乙酸= 3：1）中24小时。 H。洗涤后，将样品在4℃下储存在70％乙醇中。使用解剖针和镊子从小花中解剖花药，并将其压扁并置于玻璃载玻片上的1滴乙酸胺中。 1-2分钟后，用载玻片覆盖载玻片并在显微镜下观察（Motic BA200）。花粉育性通过正常和异常花粉粒的比例来估计，其通过在显微镜下用1％I2-KI染色（Motic BA200）观察到。正常花粉被完全染色，而异常花粉可根据染色和花粉形态分为两种类型，包括染色的流产花粉和空的流产花粉。染色的流产花粉比正常的花粉小或没有完全染色，空的流产花粉比正常的花粉小，并且是空的或无色的（Zhang和Lu 1989）。
组织学观察：
根据制造商的方案（Heraeus Kulzer）收获，固定，脱水并包埋在Leica 7022 Histeresin包埋试剂盒（7022LR）中的T449和E249的花药。用切片机（Leica RM2235）切割1-2μm厚的切片，并在60℃下干燥24小时。切片用0.5％高碘酸（m / v）和Schiff试剂[0.05％碱性品红（m / v），0.05％偏亚硫酸氢钠（m / v）和10％HCl（v / v）]染色，最后用0.05％甲苯胺蓝（m / v）（Feder和OBrien 1968）。使用显微镜（Motic BA200）观察并拍摄花药切片。
花药中糖类含量的测定：
收集减数分裂和单个小孢子阶段的T449和E249的花药，以使用DAPI荧光染色法确认花粉发育阶段（表S1）。将500mg新鲜花药样品在110℃下在烘箱中风干15分钟，并在相同的烘箱中在65℃下保持12小时。用80％乙醇水溶液提取50mg干燥花药样品，然后置于80℃的热水浴中40分钟。将样品以4000rpm离心10分钟并除去上清液。重复相同的过程两次，收集上清液。将活性炭加入到上清液中，在80℃下脱色10分钟，并将体积调节至5ml。最后，将混合的上清液过滤并制备以使用购自苏州科明生物工程公司（中国苏州科明生物工程公司）的试剂盒测量果糖，葡萄糖和蔗糖的含量。所有测量一式三份进行。
全基因组重测序分析：
使用改良的CTAB方法（CotaSanchez等人，2006）从幼叶中提取E249和T449的基因组DNA。该库根据制造商的方案制备。基因组重测序在Illumina Hiseq 2500平台（Biomarker Technologies，Beijing，China）上进行。该程序根据标准Illumina方案进行。使用FastQC评估生成的FASTQ文件质量（http：//www.bioin forma tics.babra ham.ac.uk/proje cts / fastq
C/）。取出低质量的读数[用测序衔接子读取，含有超过10％N的读数，读取含有超过50％的低质量碱基（<10）]，然后将过滤后的高质量读数映射到使用BWA软件的Nipponbare参考基因组。通过GATK软件检测SNP和InDel，并检测SNP的碱基突变，相应染色体的物理位置，小InDel的大小和相应染色体上的位置。使用FREEC软件识别拷贝数变异（CNV），断点阈值为0.8（窗口= 50,000），而其他参数设置为默认值。使用SnpEff软件注释SNP和InDel，并且基于Nipponbare参考基因组的GFF文件注释CNV。
验证SNP和InDels：
基于重新测序结果，随机选择38个SNP和InDel进行验证。使用Primer Premier 5.0设计寡核苷酸引物，产物长度范围为400-800bp（表S2）。使用E249和T449的基因组DNA作为模板通过聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA。 PCR过程为94℃5分钟，然后进行35个循环：95℃45秒，55℃45秒和72℃1分钟，最后在72℃延伸5分钟。通过Sanger测序对PCR产物进行测序，并使用ClustalW软件进行序列比对。
RNA提取和RNA-seq实验：
在减数分裂和单个小孢子阶段从花药中提取总RNA。将所有样品收集在三个生物学重复中并在-80℃下储存用于RNA沉淀。根据TRIzol试剂（Life technologies，California，USA）的手册说明从每个样品中提取总RNA。该库根据制造商的方案制备。 RNA-seq在Illumina HiSeq 2500测序平台（Biomarker Technologies，Beijing，China）上进行。使用Illumina配对末端RNA-seq方法，我们对产生数百万个配对末端读数的转录组进行了测序。取出低质量读数（接头序列，未知核苷酸> 5％，或Q20 <20％[测序错误率<1％的序列的百分比]]。使用具有默认参数的Bowtie2和Tophat2软件将从原始读数中过滤的清洁读数映射到Nipponbare参考基因组上。进一步检查来自BAM / SAM格式的对准器的对齐记录，以消除可能的重复。使用DESeq包（Anders和Huber 2010）检测样品之间的基因表达差异。每千碱基的片段（每百万片段映射的转录物的FPKM）值用于估计基因表达水平（Trapnell等人，2010）。错误发现率（FDR）用于确定多次测试中p值的阈值。使用FDR≤0.05和log2的绝对值（倍数变化）≥1，将基因用于后续分析。
RNA-seq数据的统计分析
在归一化之后使用Cluster 3.0软件执行分层分析。 Venny软件用于鉴定不同样品中重叠的差异表达基因（http：// bioin fogp.cnb.csic.es/tools/venny/）。转录因子数据从数据库DRTF下载（Jin等人，2017）。使用植物GeneSet富集分析工具包（http：// struc tural biolo gy.cau.edu.cn/Plant GSEA /）和AgriGO工具（http：/）对基因本体（GO）富集分析进行差异表达基因的功能分类。 / bioin fo.cau.edu.cn/agriG O /）。
Statistical analysis of RNA‑seq data
Hierarchical analysis was performed using Cluster 3.0 software after normalization. Venny software was used to identify the overlapped differentially expressed genes in different samples (http://bioin fogp.cnb.csic.es/tools /venny /). Transcription factor data were downloaded from the database DRTF (Jin et al. 2017). Gene ontology (GO) enrichment analysis was employed for functional categorization of differentially expressed genes using the Plant GeneSet Enrichment Analysis Toolkit (http://struc tural biolo gy.cau. edu.cn/Plant GSEA/) and AgriGO tool (http://bioin fo.cau. edu.cn/agriG O/).

实时qRT-PCR分析
通过qRTPCR选择总共18个进行验证。使用Primer Premier 5.0软件设计基因特异性引物（表S3）。总RNA取自
测序样品，并使用PrimeScript TM II第一链cDNA合成试剂盒（TaKaRa）根据制造商的说明合成第一链cDNA。使用具有gDNA Eraser（TaKaRa）的Prime Script RT试剂盒，在Lightcycler480系统（Roche）上进行qRT-PCR。 qRT-PCR反应条件在95℃下为30秒，进行40个循环的95℃变性5秒和60℃退火并延伸20秒。使用2-ΔΔCt方法（Livak和Schmittgen 2001）计算基因的相对表达水平。所有qRT-PCR反应一式三份进行。
数据可用性
所有数据均以登录号PRJNA436888提交至NCBI序列读取存档数据库。
结果
同源四倍体水稻的特征（T449）
主要农艺性状（图1）在T449和E249之间检测到明显差异，包括株高，粒长，粒宽，千粒重和穗长，但旗叶长度和穗长无显着差异。宽度（表1）。 T449的粒长，粒宽和千粒重显着增大，株高和有效穗数显着低于E249（表1和图1）。此外，在T449中发现了染色的流产和空的流产花粉（图1），T449中的花粉育性和结实率分别为54.09和34.47％，显着低于E249（表1）。这些结果表明，T449比其二倍体对应物具有明显的生物量优势，并且在农艺性状上显示出显着差异。
图1同源四倍体（T449）和二倍体水稻（E249）的植株类型，粒形和花粉育性。植物外观为T449和E249，b颗粒形状为T449和E249，bar = 1 cm。通过用1％I2-KI染色观察到E249（c）和T449（d）的花粉育性。蓝色箭头表示染色的流产花粉，绿色箭头表示空的流产花粉，红色箭头表示正常的花粉。棒=100μm。（彩色图在线）

图2同源四倍体水稻品系PMC减数分裂过程中的染色体行为。 a Zygotene，b，c pachytene，d diplotene，e diakinesis，f metaphase，i，g anaphase I，h telophase I，i metaphase II，j anaphase II，k telophase II，l tetrad stage，m abnormal phaphase I，n abnormal后期I，o异常中期II，p异常四分体阶段。棒=10μm
同源四倍体水稻PMC减数分裂过程中的染色体行为
T449中的减数分裂阶段与E249一致，可分为9个发育阶段，包括前期I（leptotene，zygotene，pachytene，diplotene和diakinesis）（图S1A，B和图2a-e），中期I （图S1C和图2f），后期I（图S1D和图2g），末期I（图S1E和图2h），前期II，中期II（图S1F和图2i），后期II（图S1G和图2j），末期II（图S1H和图2k）和四分体（图S1I和图21）。二价是E249中运动和中期I中最常见的染色体构型，而在同一阶段T449中四价最常见（表2）。在T449中观察到许多异常的染色体行为，包括在中期I的染色体滞后（图2m），在后期I的染色体分散（图2n），在中期II的异常纺锤体（图2o）和在三联体中的异步细胞分裂。阶段（图2p）。在减数分裂I期间，T449染色体异常的平均频率分别比中期I，后期I和末期I的E249高40.36,20.69和2.62％。在减数分裂II中，T449的平均异常频率分别比中期II，后期II，末期II和四分体的E249高31.62,56.03,7.96和4.65％（表3）。

同源四倍体和二倍体水稻的全基因组重测序：
使用重新测序在E249和T449中获得总共107131936和100395344清洁读数，并分别从107605398和100940422原始读数中过滤。 E249和T449的G / C含量分别为44.48和45.1％。将大约98.34％（E249）和98.13％（T449）的清洁读数分别定位于Nipponbare参考基因组上。此外，这些读数的94.96和94.44％被独特地映射，在10倍覆盖深度处发现94.32和93.88％，并且在E249和T449中读数的覆盖深度分别为37×和35×（表4）。为了理解E249和T449之间的基因组变异，进一步分析了DNA多态性。应用两种过滤条件（覆盖≥10且≤100，去除杂合SNP和InDel）以最小化假阳性SNP和InDels的检测
在E249和T449之间。与E249相比，在T449中鉴定出总共81个SNP和182个InDel（表S4）。为了使用Sanger测序验证，我们在PCR扩增后随机选择了来自E249 / T449的38个SNP和InDel的变异位点。 DNA序列与重新测序数据一致，表明重测序数据是可靠的。仅检测到3个非同义SNP和6个大效InDel，分别与3个和6个基因相关，包括半胱氨酸蛋白酶家族基因（Os04g0402300），甲基转移酶（Os09g0415700），果胶酶（Os01g0634600），抗病基因（ Os11g0224900），黄萎病抗病基因（Os01g0158600），两种NBSLRR型抗病基因（Os11g0597700和Os11g0686500），以及两种表达基因（Os08g0528700和Os10g0134033，表S4）。然而，在T449和E249之间的花粉不育基因座Sa和Sb以及S5基因没有变化。这些结果表明，T449花粉育性低的原因可能不是SNP和InDel变异。在E249和T449之间共检测到60个CNV，其与617个基因相关。 617个基因的GO富集分析显示13个GO术语在生物过程类别中显着富集，并且在细胞组分类别中仅检测到膜（GO：0016020）术语（表S5）。在分子功能类别中检测到五个GO术语，包括转移酶活性（GO：0016740），激酶活性（GO：001630），转移酶活性，转移含磷基团（GO：0016772），催化活性（GO：0003824），和脂质结合（GO：0008289）。此外，我们将T449中与CNV相关的基因与水稻花药减数分裂阶段相关基因的报道数据进行了比较（Fujita等人2010; Yant等人2013; Wright等人2015）。我们从这些比较中鉴定了两个与减数分裂相关的基因，包括OsAM1（Os03g0650400），它在减数分裂开始时构建正确的染色体结构（Che等人2011）和RAD17（Os03g0242100），它们调节DNA损伤。修复和同源重组（Heitzeberg等，2004）。然而，根据qRT-PCR结果，两个减数分裂相关基因的表达模式在E249和T449之间显示出非显着变化（图S2）。

同源四倍体和二倍体水稻中差异表达的基因：
减数分裂和单个小孢子阶段在确定水稻花粉育性中起重要作用。因此，与E249相比，RNAseq用于研究T449中两个阶段的整体基因表达。总的来说，在减数分裂和单个小孢子阶段的花药中检测到大约2.3亿个清洁读数。将清洁读数与Nipponbare参考基因组比对，并且分别在T449和E249中获得84.28-89.73％注释的参考基因组转录物（表S6）。在三个生物学复制中，所有相关系数均高于0.85（表S7），主成分分析（PCA）显示每个发育阶段的复制样本聚集在一起（图S3），这表明表达模式具有高度的相似性在生物复制之间。使用qRT-PCR选择总共18个基因来确认RNA-seq数据，包括分别在减数分裂和单个小孢子阶段的11和7个基因。结果与RNA-seq数据一致（图S4），表明RNA-seq数据是可靠的。总共有4944个基因显示差异表达模式，包括分别与E249相比在减数分裂中的1645和3299个基因以及T449中的单个小孢子阶段（图3a，表S8和S9）。在这些DEG中，524个基因在减数分裂阶段被发现下调，但在单个小孢子阶段上调，而336个基因在减数分裂阶段上调，但在单个小孢子阶段下调（图3b）。在减数分裂和单个小孢子阶段的比较中，分别在E249和T449中检测到7968和4659°。在这些DEG中，1024个下调基因和1376个上调基因在E249和T449中是常见的（图。
S5A）。这些结果表明，在不同的倍性水稻中，许多基因从减数分裂到单个小孢子阶段表达。减数分裂和单个小孢子阶段的比较分析显示，E249中280个基因上调，但T449中下调，E249中229个基因下调，但T449中上调（图S5A）。一些基因在不同的倍性水平和花粉发育阶段特异性共表达（图S5B）。这些结果表明，在不同倍性水稻的减数分裂和单个小孢子阶段，基因具有转录活性。在这4944个DEG中，可分为6组（图3c），160个属于编码转录因子（TFs）的36个家族，包括分别在减数分裂和单个小孢子阶段表达的73和133°（图S6）。）。 NAC家族在两个阶段都是最丰富的，包括分别在减数分裂和单个小孢子阶段的12和16个NAC TF。其中，27和86个TF分别在减数分裂和单个小孢子阶段特异性表达。四个转录因子（GATA，GRAS，MYB，和MYB相关）均显著下调，和三个转录因子（C3H，CO-等，MIKC）被发现在这两个发展阶段（见表S10）上调。对4944°的基因本体论（GO）富集分析表明，与E249相比，T449的减数分裂和单个小孢子阶段共有29和37个GO项显着富集。在生物过程类别中，GO术语与前体代谢物和能量的产生有关（GO：0006091），对非生物刺激的反应（GO：0009628），对生物刺激的反应（GO：0009607），分解代谢过程（GO：0009056）在两个发育阶段都检测到碳水化合物代谢过程（GO：0005975）。在分子功能类别中，催化活性（GO：0003824）和转运蛋白活性（GO：0005215）在两个阶段都富集。总共11个GO术语，如质体（GO：0009536），细胞膜结合细胞器（GO：0043231），膜结合细胞器（GO：0043227），细胞内细胞器（GO：0043229）和细胞器（GO：0043226）在两个开发阶段（图S7，S8和S9）中，在细胞成分类别中进行了鉴定。
KEGG途径分析显示，与E249相比，在T449中，在减数分裂阶段的1645个中的237个和在单个小孢子阶段的3299个中的444个中富集了26个功能项。有趣的是，在减数分裂和单个小孢子阶段期间，61和101°分别涉及碳水化合物代谢类别（图S10）。上述DEGs在117个子类别中得到丰富，检测到28个重要术语。碳代谢（ko01200），乙醛酸和二羧酸代谢（ko00630），甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢（ko00260），光合作用（ko00195），过氧化物酶体（ko04146），光合作用天线蛋白（ko00196），淀粉和蔗糖代谢（ko00500））在两个开发阶段都是重要的类别（图S11）。总体而言，GO和KEGG分析结果显示T449和E249在T449花粉发育过程中碳水化合物代谢过程与E249相比存在显着差异，DEGs参与蔗糖合酶，葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶，6-磷酸果糖激酶和己糖激酶。蔗糖通过转化酶和蔗糖合成酶分解成单糖，其被转运到细胞中并用于淀粉生物合成和其他功能（Ruan等人2010; Ruan 2012）。蔗糖合成酶基因（SUS3）和己糖激酶基因（OsHXK1）在减数分裂阶段显着下调。两个蔗糖合酶基因（SUS2和SUS3）和
三个己糖激酶基因（OsHXK1，OsHXK3和OsHXK7）被上调，并且发现己糖激酶基因（OsHXK10）在单个小孢子阶段被下调（表S11）。单糖和蔗糖转运蛋白在糖类从源到汇的运输中起着关键作用（Smeekens 2000; Wang et al.2008）。在减数分裂阶段，发现单糖转运蛋白（OsMST6）被下调。一个蔗糖转运蛋白（OsSUT5）和两个单糖转运蛋白（OsMST1和OsMST8）也在单个小孢子阶段表现出下调，并且它们的表达模式通过qRTPCR确认（表S11和图S4）。这些结果表明，糖转运蛋白可能在花粉发育过程中引起T449的源 - 库不平衡。
图3同源四倍体水稻中的差异表达基因（DEG）与减数分裂和单个小孢子阶段的二倍体水稻相比。 a两种阶段中同源四倍体水稻的上调和下调DEG数量与二倍体对应物的数量。 b两种阶段同源四倍体水稻中DEGs与二倍体水稻相比的维恩图。 c同源四倍体水稻与其二倍体对应物在两个阶段中DEG的表达模式。 MA和SCP分别代表减数分裂和单个小孢子阶段。与减数分裂期的二倍体水稻相比，MA-up和MAdown分别代表同源四倍体水稻中的上调和下调基因。与单倍小孢子期的二倍体水稻相比，SCP-up和SCP-down分别代表同源四倍体水稻中的上调和下调基因。
减数分裂和单个小孢子阶段中花药中糖含量的测定
为了验证我们推测糖类转运蛋白干扰源 - 库关系，在花粉发育过程中在T449和E249中研究了糖的分布。结果显示，在预生殖和减数分裂阶段期间，糖类聚集在E249和T449的结缔域（图4）。然而，在单个小孢子阶段期间T449和E249之间的糖分布存在显着差异（图4），并且在T449中在结缔组织区域积累了大量糖类，但在E249中观察到较少的糖类（图4）。此外，我们研究了花粉发育过程中果糖，葡萄糖和蔗糖的含量。在减数分裂阶段，T449中葡萄糖和蔗糖含量显着增加，但T449和E249之间果糖含量没有显着差异。在单个小孢子阶段，内容
T449中果糖和葡萄糖的含量显着增加，但T449和E249之间的蔗糖含量没有明显差异（图5）。这些结果表明，在单个小孢子阶段，单糖（果糖和葡萄糖）在T449中显着积累。
减数分裂相关和减数分裂特异性基因在同源四倍体水稻中表现出下调
由于比较转录组分析用于分析花粉母细胞（PMC）减数分裂过程中的DEGs，我们集中于在减数分裂阶段T449与E249之间检测到的减数分裂阶段特异性和减数分裂相关基因。我们将DEG与水稻或拟南芥减数分裂阶段特异性基因和减数分裂相关基因的转录组数据进行了比较（Fujita等人2010; Tang等人2010; Deveshwar等人2011; Yant等人2013; Wright等人。 2015），并鉴定了五个减数分裂相关基因和70个减数分裂期特异性基因（表S12）。
图4同源四倍体水稻及其二倍体对照的花药中糖分布模式的比较。在二倍体水稻中的花粉横切面的预生育期（a），减数分裂期（b）和单个小孢子期（c）。在同源四倍体水稻中，减数分裂前阶段（d），减数分裂阶段（e）和单个小孢子阶段（f）的花药横切面。棒=100μm。箭头表示糖类

图5同源四倍体和单倍小孢子期同源四倍体和二倍体花药中花药的含量。葡萄糖。 b果糖。 c蔗糖。 MA和SCP代表减数分裂和单个小孢子
阶段，分别。 *和**分别代表p <0.05和p <0.01的显着差异。（彩色图在线）
与E249相比，这些基因在T449中表现出至少两倍的变化，包括9个上调基因和66个下调基因。有趣的是，发现60个基因在减数分裂阶段下调，但在单个小孢子阶段上调，只有两个基因表现出相反的趋势，即在减数分裂阶段上调，但在下调单个小孢子阶段。 75个特定基因中的13个在减数分裂阶段显示差异表达模式，包括6个上调基因和7个下调基因。此外，还检测到五个减数分裂相关基因，包括一个上调基因和四个下调基因。上调的减数分裂相关（Os05g0274200）基因编码DNA错配修复蛋白。发现四种减数分裂相关基因，即拓扑异构酶B（OsMTOPVIB，Os06g0708200），F-box（OsMOF，Os04g0464966），细胞周期蛋白依赖性激酶F-2（Os10g0157200）和细胞周期蛋白依赖性激酶G-1（Os12g0432000）。通过qRT-PCR验证它们的表达水平（图S4）。我们使用STRING v10进行了75种减数分裂阶段特异性和减数分裂相关基因的预测蛋白质 - 蛋白质相互作用。结果表明，17个基因构成了2个主要的遗传子网络（图6），均在减数分裂阶段表现出下调，包括2个减数分裂相关基因和15个减数分裂特异性基因。减数分裂相关基因Os12g0432000编码细胞周期蛋白依赖性激酶G-1并与两种减数分裂特异性基因相互作用，包括两个细胞周期蛋白基因（Os02g0604800和Os02g0607100）。减数分裂相关基因Os10g0157200注释为细胞周期蛋白依赖性激酶F-2，其与五种减数分裂特异性基因相互作用，包括两个细胞周期蛋白基因（Os02g0604800和Os02g0607100），两个含二聚体结构域的基因（Skp1家族，Os09g0273800和Os06g0113800））和SKP1样基因（Os09g0274800）。
讨论
全基因组重新测序表明，低生育力不是由同源四倍体和二倍体水稻之间的SNP和InDels变异引起的。
新一代测序技术使大规模基因组的重新测序，DNA变异的检测以及多态分子标记的开发成为可能（Weigel和Mott，2009; Huang等，2012）。以前的研究报道了二倍体水稻基因组序列的多态性，发现了丰富的遗传变异和重要的突变基因（Jain等，2014; Fu等，2016）。在本研究中，与二倍体水稻相比，在同源四倍体水稻中共检测到82个SNP和182个InDel，并且仅鉴定了3个非同义SNP和6个大效InDel，其与3个和6个基因/蛋白质相关，分别。这些基因/蛋白质与不同类别相关，如四种抗病基因（Os11g0224900，Os01g0158600，Os11g0597700和Os11g0686500），半胱氨酸蛋白酶家族基因（Os04g0402300），甲基转移酶（Os09g0415700），果胶酶（Os01g0634600）和两种表达蛋白。（Os08g0528700和Os10g0134033，表S4）。该结果表明，同源四倍体和二倍体水稻之间花粉育性的差异不是由SNP和InDel变异引起的。虽然检测到与617个基因相关的60个CNV，包括两个减数分裂相关基因，但两个减数分裂相关基因的表达模式在减数分裂和单小孢子阶段通过qRT-表现出二倍体和同源四倍体水稻之间的非显着差异。 PCR。该结果还表明，CNV变异可能不是同源四倍体水稻低育性的主要原因。
图6 meiosisspecific（黑色）和meiosisrelated（红色）基因的预测蛋白质 - 蛋白质相互作用网络。在减数分裂过程中使用减数分裂特异性和减数分裂相关的不同表达基因在同源四倍体和二倍体水稻之间构建的预测的蛋白质 - 蛋白质相互作用子网。（彩色图在线）

减数分裂相关基因突变和染色体行为异常可导致同源四倍体水稻部分花粉不育：
减数分裂过程对植物生殖发育有很大影响（Luo et al.2014）。同源四倍体水稻具有四组同源染色体，同源四倍体水稻的染色体行为比二倍体水稻更复杂。染色体异常行为是同源四倍体水稻花粉败育的主要原因（Luan等，2007,2009; He等，2011a，b; Wu等，2014）。同源四倍体水稻中存在许多类型的异常染色体行为，包括染色体分散和染色体滞后（Wu等人，2014）。在目前的工作中，在同源四倍体水稻中发现了高频率的异常染色体行为，特别是在后期II中。同源四倍体水稻与二倍体水稻的染色体构型存在明显差异，同源四倍体水稻的单叶和多价频率高于二倍体水稻。在先前的研究中，在植物中检测到许多减数分裂相关基因（Fujita等人2010; Yant等人2013; Luo等人2014; Wright等人2015），以及超过300种减数分裂特异性基因在水稻花药中鉴定出（Fujita等人2010; Tang等人2010; Deveshwar等人2011）。 1个减数分裂相关基因和54个减数分裂阶段特异性基因的下调增加了同源四倍体水稻杂种中的花粉不育基因座相互作用（Wu等人，2015）。在本研究中，我们检测到5个减数分裂相关基因和70个减数分裂特异性基因，这些基因在同源四倍体水稻和其二倍体对应物之间显示出显着的差异表达模式。四个减数分裂相关基因表现出下调，并参与DNA双链DNA断裂（DSBs）的形成，以及雄性减数分裂过程中的突触和重组。 OsMTOPVIB（Os06g0708200）是TopoVIB样蛋白，对减数分裂DSB形成至关重要（Xue et al.2016）。 OsMOF（Os04g0464966）是一种F-box基因，其在细胞前期主要活跃于前期I的粗线期，并参与端粒花束形成，同源染色体配对和突触以及DSB修复（He等人，2016）。 OsMTOPVIB和OsMOF的下调可能增加T449中运动障碍和中期I的单价和三价体的数量。 Os10g0157200和Os12g0432000编码的细胞周期蛋白依赖性激酶，其与拟南芥中的CDGK1同源。 CDKG1蛋白激酶对拟南芥雄性减数分裂过程中的突触和重组至关重要（Zheng等，2014）。 CDKG1的下调可能增加同源四倍体水稻中染色体突触异常的百分比。这些减数分裂相关和减数分裂特异性基因的突然表达模式可能导致染色体行为异常，并导致同源四倍体水稻的花粉育性低。
糖类代谢相关基因的表达变化可能导致糖类异常分布并导致同源四倍体水稻部分花粉不育
碳水化合物是成熟花粉中的主要营养素，为花粉管生长和花粉发育提供必需的能量。减数分裂和小孢子阶段是至关重要的阶段，它们从绒毡层向小孢子提供碳水化合物。该过程涉及多糖的转运和降解，单糖的形成和转运，以及淀粉的产生和降解（Lim等人2006; Kocal等人2008; Ruan等人2010）。蔗糖转运蛋白是蔗糖从源到器官移位的重要蛋白质（Smeekens，2000）。 Lemoine等人。（1999）在烟草中鉴定了花粉特异性蔗糖转运蛋白（NtSUT3），其参与花粉发育并为花粉管提供营养。 OsSUT1基因的缺失可能损害水稻的花粉功能（Hirose等，2010）。这些研究表明蔗糖转运蛋白在植物花粉发育中起重要作用。在我们的研究中，蔗糖转运蛋白（OsSUT5）在单个小孢子阶段在T449中下调，这可能影响花粉发育过程中蔗糖的供应。蔗糖转化酶和蔗糖合酶是植物蔗糖代谢中的两种关键酶（Hirose等人，2008; Ruan，2012）。在这里，RNA-seq数据表现出蔗糖转化酶基因表达的无显着变化。蔗糖合酶3（OsSUS3）在减数分裂阶段下调，在单个小孢子阶段上调，OsSUS2在单个小孢子阶段上调。此外，己糖激酶基因对植物糖信号传导途径有很大影响（Cho等，2006,2009; Kim等，2016）。己糖激酶10（OsHXK10）在花粉萌发，花药开裂以及水稻籽粒灌浆中起着至关重要的作用（Xu et al.2008）。这里，三个己糖激酶基因（OsHXK1，OsHXK3和OsHXK7）在单个小孢子阶段显着上调。发现己糖激酶基因OsHXK1和OsHXK10在减数分裂阶段和同源四倍体水稻中的单小孢子阶段与二倍体对应物相比下调。我们推测蔗糖合成酶和己糖激酶基因的突然表达可能导致同源四倍体水稻花粉发育异常。单糖转运蛋白在花粉发育中起重要作用（Wang等人，2008）。在此，同源四倍体水稻花药的横截面显示，与二倍体水稻不同，在单个小孢子期期间许多糖类在结缔组织区域积累（图4）。此外，在单小孢子期，同源四倍体水稻的单糖含量显着高于二倍体水稻（图5）。单糖转运蛋白8（OsMST8）的表达对水稻的花粉发育具有显着影响（Mamun等人，2006）。 OsmST8的表达水平在cas突变体中显着降低，其降低了花器官的糖含量并导致花粉不育（Zhang等人，2010）。类似地，发现OsMST8在同源四倍体水稻的单小孢子期期间下调，其显示部分花粉不育。这些结果表明，单糖的异常积累和单糖转运蛋白的差异表达可能导致同源四倍体水稻部分花粉败育。总之，在同源四倍体水稻中观察到异常的染色体行为和糖类分布，并且许多减数分裂和碳水化合物代谢相关基因在同源四倍体水稻的花粉发育过程中表现出突然的表达模式。因此，我们推断这些基因的差异表达模式可能导致同源四倍体水稻的花粉育性低。我们的研究结果进一步加深了对同源四倍体水稻花粉发育的认识，并揭示了同源四倍体水稻中碳水化合物代谢和染色体行为异常共同导致部分花粉败育。未来的研究将集中在减数分裂和糖代谢相关基因的功能分析，这些基因在同源四倍体水稻中与二倍体水稻相比下调。
致谢作者感谢Yuhu Yu女士和其他实验室成员的帮助。
数据可用性所有数据均以登录号PRJNA436888提交给NCBI序列读取存档数据库。
作者贡献XDL和MQS构思并设计了实验。 LC，MQS和XDL撰写了这篇论文。 LC，MQS，JWW，ZXC和LW进行了实验并分析了数据。所有作者阅读并认可的终稿。
资助这项工作得到了国家自然科学基金委员会（NSFC）向XD Liu（批准号31571625），广州科技计划项目XD Liu（批准号201707020015），广东省自然科学基金资助项目到MQ Shahid（Grant no.2017A030313142）和广东科技计划到XD Liu（Grant no.2017A030303069）。
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