在培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时，还应考虑***的吸收，可在加入***的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。

· 金属对CCK-8显色有影响：当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会***5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话，将会*****。

· 悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。

· 加入CCK-8 时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色或pH 值已变化，建议换用新鲜的培养基。

·  用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定，且要擦拭干净样品板了。

CCK8的实验步骤、实验分组及检测方法.北京cck8数据作图

cck8试剂加入后孵育时间，随着时间的增加，OD值就会增大。总之原则就是把OD值控制在1.0左右。这里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。

再说一下关于种板设置问题。众所周知周围一圈孔因为边缘效应都是不用来做实验的。一般每组样品我会设置6个复孔，得到的OD值去掉**大值与**小值，其余取平均值。我用的是排***，会省很多力气，但是也会增大组内误差。这个只有通过校正移液***和选用**适***头了。

能力有限，表达不清的大家凑合着看看吧。有疑问的欢迎大家留言讨论，我们的目标是共同进步，哈哈。

上海cck8中国**药敏试验：这个是用的比较广的，我见过做**的团队，买CCK-8都是一整箱，一整箱的买。

注意事项1、细胞密度：MTT要检测的只是细胞的增殖能力，所以不用保证孔内细胞铺板一定要均匀，只要保证孔与孔之间的细胞数量大致相同就可，也因此细胞重悬很重要。每孔加入之前，都需要吹打混匀细胞，但即便如此也很难保证每个孔的细胞数量大致一致。所以我们设置了6组实验组，以便计算结果时可以有所取舍。

2、对于MTT而言，预实验很重要。预实验要摸清楚两点：a)细胞该如何稀释；b)***浓度。网上很多人建议将细胞数稀释到某个数值才是**合适的，但我认为只要保证每个孔内的细胞数在70%左右，且各个孔内细胞数量大致相同就可，不需要强求一定要达到某个数值，现实中，这一步需要多次摸索。

CCK8原理、优势和步骤 检测原理：

◆ Cell Counting Kit简称CCK试剂盒，是一种基于WST-8(化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。

◆ WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物(formazan)。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。

酚红和血清对CCK法的检测不会造成干扰；

当使用标准96孔板时，贴壁细胞的**小接种量至少为1000 个/孔(100μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2500 个/孔(100μl培养基)。酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

三、注意事项CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。当在培养箱内培养时，培养板**外一圈的孔**容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，**外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。在培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。

代谢率低了以后，细胞呼吸减弱，NAD+产生减少，测出的Formazan也会减少。浙江cck8 od值统计方法

不同的种板数对检测***的IC50影响大吗？北京cck8数据作图

细胞活性检测

1. 在96 孔板中接种细胞悬液 (100 ml /孔 ) 。将培养板放在培养箱预培养 (在37 ℃，5% CO2的条件下 )。

2. 向每孔加入10 ml 的CCK- 8溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响 O.D值的读数) 。

3. 将培养板在培养箱内孵育 1-4小时。

4. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

5. 如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入 10 ml0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在 24小时内吸光度不会发生变化。

细胞增殖 -毒性检测

1. 在96 孔板中配制 100 ml的细胞悬液。将培养板在培养箱预培养 24小时 ( 在37℃， 5% CO2的条件下 )。

北京cck8数据作图