从零开始学PCR技术（三）：PCR引物设计

扩增子测序在临床基因检测中有广泛应用，合理的 Panel 设计非常重要，而 Panel 设计最终要落地，精心设计引物就是重中之重了。

本文通过公开资料整理而成，志在让外行了解一些引物设计的基础知识，深入研究请参考专业文献。本文仅供学习参考，不构成任何具体建议。

背景：DNA 热力学

DNA 热力学是指温度影响双链 DNA（double-stranded DNA，dsDNA）的核酸结构。这部分知识是难的，但如果不深入了解，引物设计过程中可能会犯许多错误。

一些基础概念：

杂交：正常情况下，寡核苷酸、DNA 或 RNA 会绑定到其互补序列，互补序列的碱基之间通过氢键连接，最常见的是，核酸碱基对以 A = T 和 G≡C 的方式成对形成，其中后者更稳定(由于氢键数较多)。

溶液中的DNA

变性：又称 DNA 解链或融化，是 DNA 双链因为加热温度升高或者化学物质的诱导变成单链的过程。我们把 DNA 双链解开一半时所需要的温度称为融点（Melting temperature, T_m）。T_m依赖于 DNA 分子的长度及其特定的核酸序列组成。

复性：又称退火。单链 DNA 或 RNA 与互补的探针或引物结合形成配对的双链核苷酸的过程。

关于 PCR 的 7 个谬误及改进办法

Myth 1: PCR Nearly Always Works and Design Is Not that Important

谬误 1：PCR 随便弄就行了，反正都能工作。

有些时候或许确实如此，尤其是一重 PCR 的时候，但如果是多重 PCR 就必须要精心设计了。

Myth 2: Different Methods for Predicting Hybridization T_m Are Essentially Equivalent in Accuracy

谬误 2：随便一种方法预测寡核苷酸的 T_m值准确性都差不多。

计算 T_m最简单的公式是：

T_m = 4(G + C) + 2(A + T)

这个等式忽略了许多重要信息：T_m值依赖于链的浓度，盐分浓度以及碱基序列。这个公式得到的 T_m通常比实验测得的高 15℃。因此并不推荐使用，一个更好的公式是：

T_m = 81.5C + 16.6 × log10[Na+]+0.41(%G+C)–0.63(%formamide)–600/L

其中 L 是双链 DNA 的长度。

Myth 3: Designing Forward and Reverse Primers to Have Mathing T_m's Is the Best Strategy to Optimize for PCR

谬误 3：很多老手都相信这一点：优化 PCR 设计时，最好让上下游的引物都具有接近的 T_m。

许多软件也是基于这一策略设计的。但这是有缺陷的，用 ΔG° 比 T_m要好。

Myth 4: "Primer Dimer" Artifacts Are Due to Dimerization

谬误 4：引物二聚体只是引物的二聚化。

常见导致引物二聚体的因素有：3'端互补，5'端或中间序列互补，高循环数（>35），掺入外源基因组 DNA，引物结合靶 DNA 的效率低，使用具有校正活性的 DNA 聚合酶（Pfu 等）因 3'外切活性可能使原本不匹配的 3'端互补。

Myth 5: A BLAST Search Is the Best Method for Determing the Specificity of a Primer

谬误 5：BLAST 搜索是检验引物特异性的最佳方法。

事实上，热力学参数比序列相似性能够更好地预测引物特异性。

Myth 6: At the End of PCR, Amplification Efficiency Is Not Exponential Because the Primers or NTPs Are Exhausted or the Polymerase Looses Activity

谬误 6：PCR 平台期的出现是因为引物或 dNTP 耗尽，或者酶失去活性。

实则不然，真正导致平台期的原因是积累的 dsDNA 产物的抑制，这已经得到了实验证明。

Myth 7: Multiplex PCR Can Succeed by Optimization of Individual PCRs

谬误 7：可以通过优化单重 PCR 来优化多重 PCR。

设计良好的单重 PCR 确实有助于开发多重 PCR，但如果只使用这种策略则过于简单。还需要使用软件而不是人工来协助设计。

PCR 引物设计原则

PCR 反应中有两条引物，即 5′端引物和 3′引物。设计引物时以一条 DNA 单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段 5′端上的一小段 DNA 序列相同；3′端引物与位于待扩增片段 3′端的一小段 DNA 序列互补。

1. 引物设计基本原则

引物长度：18-26bp，可放宽至 18-30bp（有研究表明超过 30bp 再增加引物长度意义不大）；
引物碱基：G+C 含量以 40-60%为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列存在；
引物 T_m：54-58℃，可放宽至 52 ～ 62℃，GC%>60%可进一步放宽；
扩增子 T_m：>92℃；
3'端：优选三联体 WSS、SWS、TTS，二连体 GC，单体 S，尽量规避 WWW、CGW、GGG、CG；
引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过 70%，引物 3′末端连续 8 个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；
末端 2bp 最好为 GC；
引物的 5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等；
其他：避免 3'端 8bp 及以上序列与模板多位点互补，尽量避免上下游 3'端 4bp 及以上反向互补，尽量避免内部回文。

基于上述原则，怎么在实践中应用呢？这要分两种情况：(1) 基因克隆 PCR 引物设计

这种情况我们往往并没有太多选择，只能从 ATG 开始，从 TAA 等结束，什么 GC%、二聚体和错配，可能根本由不得我们。既然起点定了，那只能通过改变长度来匹配最优设计要求了。(2) 鉴定 PCR 引物设计

我们只需要确认一段 DNA 序列上的一部分，起点是相对的，我们可以在整个序列范围内搜索，引物设计的灵活性大大提高，当然搜索时间也要增加。

2. 引物设计软件

Primer Premier5.0 （自动搜索）
vOligo6 （引物评价）
vVector NTI Suit
vDNAsis
vOmiga
vDNAstar
vPrimer3 （在线服务）
ThermoBLAST

PCR 技术系列文章更新计划：

从零开始学 PCR 技术（一）：PCR 技术简介

从零开始学 PCR 技术（二）：Taq DNA 聚合酶

从零开始学 PCR 技术（三）：PCR 引物设计

从零开始学 PCR 技术（四）：常见问题

从零开始学 PCR 技术（五）：试验污染

从零开始学 PCR 技术（六）：多重 PCR 的应用

参考资料

[1]

PCR Primer Design, 《Methods In Molecular Biology》第 402 卷: www.baidu.com

[2]

PCR Primer Design: https://links.jianshu.com/go?to=http%3A%2F%2Fcshprotocols.cshlp.org%2Fcontent%2F2009%2F3%2Fpdb.ip65.full.pdf%2Bhtml

[3]

PCR 引物设计大法: https://www.jianshu.com/p/3a2f28bff33d

[4]

聚合酶链式反应: https://baike.baidu.com/item/%E8%81%9A%E5%90%88%E9%85%B6%E9%93%BE%E5%BC%8F%E5%8F%8D%E5%BA%94/555320?fromtitle=PCR&fromid=9806&fr=aladdin

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