速率法和终点法的区别_终点法 速率法 二点法
终点法
速率法
二点法
*
终点法
具有不同分子结构的物质,对光谱有选择吸收的特性,吸收光谱的可在可见光区域也可在紫外或红外光区
域。若利用物质对可见光谱的选择吸收作定量分析,此时主要表现为颜色的变化,称为比色分析法;若利用物质对紫外或
红外光区域的选择吸收作定量分析,
称为吸收分光光度法。
比色分析法和吸收分光光度法灵敏度高,
选择性好,
操作方便,
已广泛用于临床生化分析,临床诊断试剂盒基本上都采用这二种方法。
其基本原理是被测物的吸光特性符合
Lambert-Beer
定律:
A
=abc
其中A为吸光度,
a
为吸光系数或消光系数;
b
为光径,即光线通过的溶液的厚度,与比色皿有关,
c
为吸光物质在溶
液中的浓度。
在选定了试剂和仪器后,式中
a
和
b
是固定的,所以溶液中待测物质的浓度与溶液吸光度的变化成正比。当反应到一
定时间时,吸光度不再发生变化,我们称这一点为反应终点。
在终点法实验中,用以知浓度的标准液与待测标本同时测定,通过待测样品的吸光度(
A
样)与标准品吸光度(
A
标)
的比较,根据朗
-
比定律,可以计算出待测样品的浓度值(
c
样),计算公式如下:
C
测定
=
A
样品/
A
标准*
C
标准
*
酶促反应的动力学
酶促反应动力学是研究酶促反应的速度以及影响此速度的各种因素。其基本原理为一数学公式,称为米氏公
式:
v=Vmax*[S]/(Km+[S])
式中
Vmax
为最大反应速度,
Km
为米氏常数,
[S]
为底物浓度,
v
为酶反应速度。
Km
是当酶反应速度达最大反应速
度半时的底物浓度,是酶的重要的特征性物理常数,只与酶的性质有关,而与浓度无关。
米氏公式表明了底物浓度与酶反应速度间的定量关系,底物浓度是决定反应速度最重要的因素之一。
加入样品开始反应后,有几秒至几分钟的延滞期(其长短视所测对象及实验条件而定)
0
-
T1
,随后即为底物或产物
变化与时间成直线的线性期
T1
-
T2
,速度是恒定的,即为
酶促反应的初速度
。在此期间,因
[S]
很高,下降量甚微,反应
速度不受
[S]
的影响,
故此时的反应为
零级反应
,
(线性反应时间的长短也与所测对象及实验条件有关)
。
最后因多种因素,
反应进入混合反应期。
酶测定的动力学方法:酶活性测定法是酶浓度的间接测定法。只有当酶所催化的反应速度与酶浓度成正比而不受其他
因素影响时,才能根据酶所催化的反应快慢来表示酶浓度的大小,这就是所谓的酶活性的最适条件,只有在此条件下测得
酶活的大小才能真实代表酶含量的多少。
根据米氏公式,
为使酶反应初速度基本上接近
Vmax,
要求底物浓度
[S]
》
Km
,此
时
v
与
[E]
成正比,
[E]
表示酶浓度。此时的米氏公式可变为:
v=k[E]=Vmax,
这就是动力学测定酶浓度的依据所在。
*
二点法(两点固定时间法)
先让酶与底物固定作用一段时间后,再测定底物的消耗量或产物的生成量。用二点法时,同样应选用酶反应的线性期
进行测定,同时还应确定该法能测定酶活性的最高限度,对于超过此限的样品,应采用缩短反应时间或减少样品用量的办
法进行测定。
但二点法的缺点是无法了解整个反应过程是否在线性期。
*
速率法
在酶反应的最适条件下,连续监测不同反应时间内底物或产物含量的变化,从而计算出酶反应的初速度,
即酶活性的高低。
通过
酶偶联体系
测定酶活性是目前最为广泛应用的方法,即在反应体系中加入其他酶与被测酶偶联起来,常把外加的
最后一个偶联酶称为
指示酶
,其他的外加酶为
辅助酶
。使用最多的是需要辅酶Ⅰ、Ⅱ的氧化还原酶类,因为还原型辅酶Ⅰ
(
NADH
)及还原型辅酶Ⅱ(
NADPH
)在
340nm
有强烈的光吸收,因而可通过测量
340nm
处吸光度值的变化来监测
NADH
及
NAD
+的含量变化,从而获得测定酶的酶活。
另一种连续监测法是用“色素原”底物,即底物本身无色,经酶作用后成为有色物,从而可通过监测生成物含量的变
化间接得到测定酶的酶活。
在前一种方法中,如广泛应用的
ALT
(
GPT
)、
AST
(
GOT
)的速率法测定,后一种方法中有
ALP
的
AMP
法测定。
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