生物信息学习的正确姿势

NGS系列文章包括NGS基础、在线绘图、转录组分析 （Nature重磅综述|关于RNA-seq你想知道的全在这）、ChIP-seq分析 （ChIP-seq基本分析流程）、单细胞测序分析 (重磅综述：三万字长文读懂单细胞RNA测序分析的最佳实践教程)、DNA甲基化分析、重测序分析、GEO数据挖掘（典型医学设计实验GEO数据分析 (step-by-step)）、批次效应处理等内容。

哈佛大学单细胞课程|笔记汇总 （四）

（五）Count Normalization and Principal Component Analysis

获得高质量的单细胞后，单细胞RNA-seq（scRNA-seq）分析工作流程的下一步就是执行聚类。聚类的目标是将不同的细胞类型分成独特的细胞亚群。为了进行聚类，我们确定了在细胞之间表达差异最大的基因。

数值标准化

标准化最重要的目的就是使表达水平在细胞之间和/或细胞内更具有可比性。那么在标准化中主要需要处理的因素包括：

测序深度：考虑测序深度是比较细胞之间基因表达的必要条件。在下面的示例中，每个基因在细胞2中的表达似乎都增加了一倍，但这是细胞2具有两倍测序深度的结果。

因此，要准确比较细胞之间的表达，有必要对测序深度进行标准化 (什么？你做的差异基因方法不合适？)。

基因长度：需要基因长度来比较同一细胞内不同基因之间的表达。基因长度越长比对到的reads理论上会越多。如下图所示：低表达的较长基因测序到的reads数与较高表达的短基因相差不大。

• 如果进行的是5’末端或3’末端测序，则不需要考虑基因长度的影响；

• 如果使用全长测序则需要考虑。

主成分分析（PCA）

PCA是对数据降维的技术，可以用来展示样品差异和相似性，这里推荐一个学习视频：StatQuest's video（https://www.youtube.com/watch?v=_UVHneBUBW0）

下面是PCA的示例模拟过程，帮助理解：

如果你已经定量了两个样本（或细胞）中四个基因的表达，则可以绘制这些基因的表达值，其中一个样本在x轴上表示，另一个样本在y轴上表示，如下所示：

我们可以沿代表最大变化的方向在数据上画一条线，在此示例中为对角线，数据中变化第一大的变量。数据集中的最大变异是在组成两个端点的基因。我们还看到基因在该线的上方和下方有些不同。我们可以在该条线的中点绘制另一条与其垂直的线，代表数据中变化第二大的变量。

末端附近的基因 (B, C)是变异最大的基因。这些基因在数学上对线的方向影响最大。

例如，基因C值的微小变化将极大地改变较长线的方向，而基因A或基因D的微小变化对其几乎没有影响。

我们还可以旋转整个图，保证线条方向是从左到右和从上到下。现在，可以将这些线视为代表变化的轴。这些轴本质上是“主成分”，其中PC1代表数据的最大差异，PC2代表数据的第二大差异。

如果有N个细胞，以此类推。。。(PCA主成分分析实战和可视化 | 附R代码和测试数据)

确定PCs后，则需要对每个PC进行评分，按照以下步骤对所有样本PC对（sample-PC pairs）计算分数：

（1）首先，根据基因对每个PC的影响程度，为其分配“影响力”评分。对给定PC没有任何影响的基因得分接近零，而具有更大影响力的基因得分更高。PC线末端的基因将产生更大的影响，因此它们将获得更大的分数，但两端的符号相反。

（2）确定影响分数后，使用以下公式计算每个样本的分数：

Sample1 PC1 score = (read count * influence) + ... for all genes

以我们的2个样本示例，以下是分数的计算方式：

## Sample1
PC1 score = (4 * -2) + (1 * -10) + (8 * 8) + (5 * 1) = 51
PC2 score = (4 * 0.5) + (1 * 1) + (8 * -5) + (5 * 6) = -7## Sample2
PC1 score = (5 * -2) + (4 * -10) + (8 * 8) + (7 * 1) = 21
PC2 score = (5 * 0.5) + (4 * 1) + (8 * -5) + (7 * 6) = 8.5

（3）一旦为各个样本的所有PC计算了这些分数，就可以将其绘制在简单的散点图上。下面是示例图：

对于具有大量样本或细胞的数据集，通常会绘制每个样本/细胞的PC1和PC2分数。由于这些PC解释了数据集中最大的变化，因此更相似的样本/细胞将在PC1和PC2聚在一起。请参见下面的示例：

Image credit: https://github.com/AshwiniRS/Medium_Notebooks/blob/master/PCA/PCA_Iris_DataSet.ipynb

对于我们的单细胞数据，我们最终会选择10-100 PC去对细胞进行聚类分析，而不是全部基因。

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