流式细胞仪培训-零散day2

检测对象：细胞，染色体，微生物，人工合成微球。
上样包括正压上样与负压上样，负压上样与LC-MS的上样阀一致，也称蠕动泵。
电信号放大部分：PMT为光电倍增管（常用，普通），APD为雪崩二极管，长波长时（＞600nm），激发效率依旧强和稳定。
灵敏度：20MESF，MESF Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome各个峰的等量可溶性荧光分子，指流式细胞仪能够检测到的最小荧光分子数。
检测到的微粒直径：0.05~1um。
选择荧光素原则：避免选择同时使用荧光素及其耦合荧光素，因为荧光共振原理只能检测到其中一种荧光。
电压：电压过低，阴性峰与阳性峰无法分开；电压过高，加大背景噪音。
补偿：原则为，以阴性在图中位置为基准，横平竖直。
同型对照：由于存在Fc段非特异性结合（如化学键，生物键和分子之间吸引力造成的结合，使得抗体与细胞表面的Fc受体结合），如小鼠抗人，则抗体的种属来源自小鼠。
珍贵样本：可使用“刺激+阻断”的操作保证细胞分子分泌量：刺激细胞因子分泌后要用阻断剂阻断细胞外分析（阻断后保证细胞内因子含量水平，否则细胞因子均分泌到细胞外，无法检测），同时在阻断的时候注意阻断剂有毒性，应减少接触。

试剂：
11. LEGEND plex：通过流式检测蛋白含量（ELASA也是蛋白检测，酶联免疫吸附剂测定法，原理为当检测对象为抗体（如IL-1）时，试剂盒中包含该种抗原+酶+底物，当抗原抗体结合时，激活酶反应，并催化底物产生颜色，同时这种颜色与抗体的量呈正比），结构为微球+蛋白+抗体+荧光素。因为蛋白分子体积小，为符合普通流式检测蛋白分子的体积，加入微球加大体积，加入抗体和荧光素保证蛋白质能被细胞识别并被进行抗原抗体特异性结合，流式检测荧光素。
12. 微球的材料为聚苯乙烯，需要注意的是实验过程需用聚丙烯材料，不影响蛋白的量（蛋白与聚丙烯材料不易结合）。
13. 微球由5和7um的直径。
14. 通过检测抗原的浓度检测得到蛋白的含量。
15. 试剂盒中有标准品，用于设置标准曲线，可以同时检测13种因子；从价格上考虑，若因子数量超过3个，可选用该试剂盒，若目标因子数≤3，则用ELASA检测。
16. CITE Seq-基于Barcode的单细胞分析：原理是将蛋白新消息转为DNA信息，流程为：将抗体与细胞共孵育，将Genus获得（单细胞+油）-cDNA生成与纯化-cDNA扩增与纯化-测序文库构建-测序。
17. MojoSort纳米磁珠分选：分选细胞的方法有三种：密度梯度（细胞漂浮密度差异原理）、流式分选、磁珠分选。
18. 磁珠分选原理：细胞+磁珠（作用是为了在强磁场中分离细胞）+抗体（or链霉亲和素纳米磁珠）-高强度磁场（正/阳选，负/阴选）-分离。

正选：标记目的细胞；负选：标记其他细胞。
优：只需一种抗体；需要的细胞没被标记，标记杂细胞；
细胞纯度高；无需去除磁珠。
缺：对细胞产生激活作用；需多种抗体标记；适合成分较固定的样本如血液，骨髓。
19. 术语：MFI-平均荧光强度；mean平均荧光强度；median荧光强度中位数；mode众数。
20. 参数：A（area）=W（weight）*H（high）。
21. Time参数：平稳-液流稳定；上下波动-液流不稳定。

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