环境样品中病毒的富集与检测方法

病毒篇：环境样品中病毒的富集与检测方法

供稿人：张行整理编辑：谢许茵校稿：程伟

前言

病毒是一类具有特殊生命活动形式的生命体，它是专一性在活细胞内寄生的非细胞型微生物，在自然界中分布非常十分广泛。噬菌体这一病毒主要的存在形式，其数量之庞大远超人体肠道中的细菌数量（人肠道细菌的数量约10¹⁴个，但其噬菌体却有10^15~16个），被称为生物界的“暗物质”。地球上病毒（主要是噬菌体）的数量约10^30~31个，而宇宙中可观测的星星的数量为10^28~30个，比整个宇宙中星星的数量还要多。群体如此庞大的病毒体，注定其宿主多种多样。在环境中，其自然宿主包括但不限于人、动物、植物、昆虫、细菌和真菌，病毒在其宿主体内寄居并引起感染。在人类发展史上，病毒与人类疾病的关系极为密切，据不完全统计，约75%的人类传染病是由病毒引起的。不同病毒的致病性和传染性存在较大差异，有的病毒传染性较强，可引起局部地区甚至世界大流行（如当今肆虐全球的新型冠状病毒等），有的病毒病病情严重，致死率高（如艾滋病等）。除急性感染外，病毒还能引起慢性、持续性感染。

图1 人体微生物组的暗物质—噬菌体组

近些年来，由病毒尤其是新现病毒引起的感染造成的生物安全事件或公共安全事件已成为各国关注的热点。环境中如空气和水体中的病毒浓度极低，远低于临床病料中的感染量，但空气和水等介质是大多数传染性病毒性疾病的传播媒介，如何高效、准确并客观的对环境中的病毒进行实时监测就显得格外重要。如今，环境病毒学发展迅速，建立环境样品中的病毒学标准是环境病毒学家孜孜追求的目标。快速、准确、高效、经济和简便的病毒富集与检测方法是预警和防控病毒性疾病暴发的先决条件。基于此，本文对常见的病毒富集和检测方法进行概述，旨在为有关科研人员更加高效地进行病毒检测提供理论指导。

聚乙二醇（PEG）法

聚乙二醇（PEG）是一种高分子聚合物，分子量200~20000不等，不同分子质量的PEG其功能不同，研究资料表明，常用于蛋白纯化或浓缩处理细菌、病毒的PEG分子是PEG 6000和PEG 8000（马晓燕等., 2008; 叶晓艳, 2012）。在单价盐离子存在的情况下PEG能使生物分子（如DNA等）和病毒粒子在PEG分子间形成结晶，起到沉淀和浓缩病毒粒子的作用，该法在实际操作中应用较为广泛（Colombet and Sime-Ngando, 2012; Kittigul et al., 2015）。简单来说，用0.22 µm的微孔滤膜对经初步预处理后得到50 ml悬液进行过滤，收集过滤液并加入终浓度分别为10%和0.6%的PEG 8000和NaCl，于避光条件下4 ℃孵育6 h左右。接着在低温条件下8000 g离心20 min以沉淀PEG和病毒颗粒，弃上清并用适量的特制的SM缓冲液重悬沉淀样物质，随即加入一定浓度的KCl溶液后置冰上孵育20 min，以使晶状病毒粒子与PEG分子分离。最后于4 ℃ 12000 g离心10 min所得上清液即为高浓度的病毒粒子浓缩液。该方法处理后的浓缩液背景物质较多，可能是因为PEG未能完全与病毒粒子分离，在病毒粒子浓缩液中有残留造成的。

HA膜法

Katayama等（2002）提出可用带负电荷的HA膜对病毒进行富集分析。通过引入盐离子（常用MgCl₂）或者将待测的病毒悬液进行酸化处理使病毒粒子带上正电荷，将膜孔径为0.45 µm，直径为47 mm的HA膜置于真空过滤瓶上，对加有MgCl2样品的病毒悬液进行过滤，促使病毒粒子吸附到HA滤膜表面，再用一定浓度的硫酸溶液对吸附了病毒粒子的HA膜进行润洗除去阳离子后，将此膜放入装有适量氢氧化钠溶液的平皿中，60 rpm低速润洗10 min，用50 μL浓度为50 mM的硫酸和100 X的 Tris-EDTA中和膜pH值，最后4 ℃ 1500 g离心10 min获得终体积约1 mL的病毒浓缩液。Lee等（2014）用HA滤膜法对65份淡水样品进行浓缩富集，检测到了较高的人腺病毒（40%）和肠道病毒（17%）。Hennechart-Collette 等（2020）用两种不同处理方法比较不同孔径滤膜对病毒的富集效率，发现孔径0.45 µm的带正电荷滤膜对病毒的富集效果较好。通常情况下，由于背景物质的影响较小，相较于其他的病毒富集方法，HA滤膜法富集病毒往往更有利于后续的病毒形态特征的直接检测。

超速离心法

研究中，另一种常用的病毒浓缩富集处理方法是超速离心法。此方法中，病毒体通过粘性溶液迁移，直到它们达到溶液（等于病毒粒子的密度）的密度范围（Ammersbach and Bienzle, 2011）。在对待检病毒悬液进行超速离心处理富集时，可采用Peyret（2015）的试验方案，根据实际情况可酌情改动。简要可概括如下：在离心前先用孔径为0.22 µm的滤膜过滤病毒悬液，仅用以分离病毒颗粒，随即制备浓度分别为25%和70%的蔗糖溶液，先在洁净的离心管内加入1 mL的70%蔗糖溶液，再加入1 mL的25%蔗糖溶液，然后加入过滤液，封闭离心管并于4 °C 4000 g离心 3 h。回收位于25%~75%相位之间的液体，弃去上清，用1 mL的SM缓冲液重悬沉淀即为病毒浓缩液。Dias等（2020）研究结果表明，超速离心法富集处理后的病毒悬液中，其Chao-1指数为54，丰富度最高。

对样品进行浓缩富集处理后，紧接着便是要对浓缩液中的病毒样颗粒（VLPs）的物种多样性和分子多态性进行分析，常用的方法有形态学分析法、随机扩增多态性DNA（RAPD）法和宏基因组技术等。

形态学分析法

采用透射电子显微镜技术观察VLPs的形态学特征，取微量的VLPs浓缩液（约10 μL）加入200目的网格中静置片刻，用吸水纸吸去过量的浓缩液，用含有2%浓度的醋酸双氧铀对VLPs染色，再用超纯水润洗后在透射电子显微镜下观察VLPs的形态多样性。透射电镜技术是了解和观察VLPs群落总体客观分布特征和粒径大小分布的最直观、简便的方法。

细胞培养法

细胞培养法常用于病毒的分离鉴定，是根据病毒在实验动物细胞中具有传染性建立起来的检测病毒致病性的经典方法。病毒感染细胞后，细胞在局部部位发生病变，形成“斑”，我们称之为空斑形成单位（Plague forming units，PFU）。细胞培养法检测病毒的灵敏性和准确度很大程度上取决于选择的细胞培养和相应病毒的感染性强弱，可检测的病毒丰度和数量的多少与所选用的细胞株和病毒活性密切相关。该法准确可靠，但需要特定的宿主细胞，普遍实用的细胞系暂时还未被发现，导致价格昂贵，此外有些病毒很难培养（如腺病毒F401/402型）甚至根据现有的技术手段无法培养（如诺如病毒）。

将PCR法与细胞培养法结合的整合集成ICC-PCR技术的出现克服了两者各自的缺点，如PCR法只能对病毒的核酸物质进行检测，而不能区分是否具有感染性，细胞培养法耗时长等问题。ICC-PCR法可快速地对微量且具有感染性的病毒进行检测，Vero细胞和 MA-104 细胞是ICC-PCR常用的培养细胞，但细胞趋性限制了ICC-PCR可检测到的病毒种类和类型的范围（Haramoto et al., 2018）。目前，RT-PCR是用于病毒检测的最常用的方法之一，尽管其不能反应病毒是否具有感染性，但能够检测环境样品中微量存在的病毒，也能够对无法培养的病毒进行检测，对预警环境中如大气和水源等病毒安全性具有重要意义。

随机扩增多态性DNA（RAPD）法

在常规PCR技术的基础上，Williams（1990）建立了一种简便、灵敏的遗传标记新技术，即随机扩增多态性DNA（RAPD）。该技术利用人工合成的一系列单链寡聚脱氧核苷酸引物（通常10个碱基长度）扩增基因组DNA模板，扩增的PCR片段经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离来检测扩增产物DNA片段的多态性。分析时，对某一特定的寡核苷酸引物来说，其可检测的DNA基因组多态性区域是有限的，但同时使用多条引物进行反应则可覆盖几乎整个DNA基因组。因此，RAPD能对整个基因组DNA的分子多态性进行全覆盖检测。Dias等（2020）用RAPD5 5-AACGCGCAAC-3、OPL5 5-ACGCAGGCAC- 3和 P2 5-AACGGGCAGA -3三条引物对病毒多样性进行了检测，获得了丰富的指纹图谱，得到的条带位于100 ~1500 bp之间。Narr等人（2017）利用RAPD技术对不同环境中的土壤动力学特征进行了研究。该方法具有诸多优点，如灵敏度高、快速实用、多态性检出率高等，但也存在一定的弊端，如无法辨别纯和与杂合基因的扩增产物、引物较短易造成假阳性等。

图2 粪便样品中病毒样颗粒VLP核酸提取及病毒组分析简易流程（Shkoporov et al., 2019）

宏基因组技术

"下一代"测序（NGS）技术和宏基因组学（Metagenomics）的迅速发展为人们打开了研究粪便样品以及环境样本（如污水、土壤等）中新病毒的大门，越来越多的研究应用mNGS技术来检测样本中病毒群落的物种丰度和遗传多样性。宏基因组学是直接从待检样品中分离遗传物质总合的一门新兴科学，其中病毒宏基因组学以获取研究样本中所有病毒的核酸序列为基础，利用mNGS技术分析样品中病毒的遗传多样性，因此如何高效的去除非病毒基因组是重要的，可通过一系列技术手段来达到这一目的，如正切流动过滤单元等（Aw et al., 2014）。其研究策略的基本过程包括样品的处理、核酸提取和富集、文库的构建、宏基因组学文库筛选和测序分析等（图2）。病毒宏基因组技术在医药卫生、畜牧和食品等行业得到广泛应用，正不断刷新和改变人们对噬菌体—这一微生物组中的“暗物质”的认识。

小结

在对环境样品进行病毒组学研究，对样品做前处理过程中，浓缩富集病毒的方法多种多样，然而，时至今日仍然没有一种单独可行的方法能完全有效地浓缩各种类型样本中所有的病毒，不同的处理方法可能会导致末端病毒的回收率显著不同。因此，实际操作中应根据研究目的和样本类型的不同科学合理地选择适当地方法进行病毒的富集处理。同时，在单一样本中同时对病毒、原生动物和细菌做富集处理，对于更好地了解感染性疾病、加强食源性疾病的监测及保障公共卫生安全具有重要的意义。

参考文献

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Katayama, H., A. Shimasaki, and S. Ohgaki. 2002. Development of a virus concentration method and its application to detection of enterovirus and norwalk virus from coastal seawater. Appl Environ Microbiol 68(3):1033-1039.

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Shkoporov, A. N., A. G. Clooney, T. D. S. Sutton, F. J. Ryan, K. M. Daly, J. A. Nolan, S. A. McDonnell, E. V. Khokhlova, L. A. Draper, A. Forde, E. Guerin, V. Velayudhan, R. P. Ross, and C. Hill. 2019. The Human Gut Virome Is Highly Diverse, Stable, and Individual Specific. Cell Host Microbe 26(4):527-541 e525.

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