从pg级DNA中获得高效、高保真的宏基因组数据：文库制备方法和去污染算法的评估

Toward efficient and high-fidelity metagenomic data from sub-nanogram DNA: evaluation of library preparation and decontamination methods

Research article，2022-10-8，BMC Biology，[IF 7.43]

DOI：10.1186/s12915-022-01418-9

原文链接：https://doi.org/10.1186/s12915-022-01418-9

第一作者：王淳，张莉

通讯作者：李明锟，张莉

主要单位：中科院北京基因组研究所（国家生物信息中心）

- 摘要 -

宏基因组测序大大扩展了人们对各种生态位中微生物群落的理解。然而，将低于1ng的DNA转换为高质量的宏基因组文库并且获得高保真数据仍然面临挑战。在本研究中，作者评估了多种文库制备方法在0.5 pg-5 ng合成微生物群落DNA上的表现，描绘了污染特征，并进一步应用不同算法去除污染。首先，作者发现制备文库前进行全基因组扩增的方法（WGA）比直接制备文库的方法（non-WGA）获得的结果更差。随后作者从保真性、真实组分的比例及可重复性等方面评估了不同的non-WGA方法，发现基于内切酶的方法在不同模板起始量中都能取得比较好的效果，而基于转座酶的方法在0.5 pg模板量时显示了特别的优势。不同方法在文库制备过程中引入污染微生物的DNA量从0.01到15.59 pg不等，占总序列数的比例为0.05%至45.97％。有相当一部分污染物属于人体共生微生物和病原微生物，因此可能导致人体微生物组研究中的错误结论。此外，在作者评估的多个去污染算法中，decontam-either表现最好；当污染物在总序列数中的比例低于10%时，能够使用decontam-either从文库中获取真实的微生物群落；但是当污染比例和异质性过高时，decontam-either也无能为力。综上所述，本研究证明，结合适当的文库制备方法和去污染算法，可以从低于1 ng的微量DNA样本中获得高质量宏基因组数据。本研究为不同微生物载量的样本的宏基因组学研究方法提供了参考。

- 引言 -

高通量测序为微生物组研究带来了革命性的进展，尤其是宏基因组学能够提供前所未有的详细的微生物信息。越来越多的研究涉及各种人体和环境生态位中的微生物群落，包括皮肤拭子、脑脊液、胎盘、极地、深海、大气和化石等微生物量很低的样本。这些样本的DNA含量可以低至pg级别。尽管16S rDNA扩增子测序克服了起始DNA材料不足的问题，被广泛应用，但不能提供功能信息和物种/菌株水平上的物种分类信息。因此，对于微生物量低的生态系统，迫切需要宏基因组学研究揭示微生物组成和功能信息。

目前有两种策略用来解决低于1 ng DNA的宏基因组学研究。第一种方法是在常规文库构建之前使用各种扩增方法增加DNA含量，其中全基因组扩增（WGA，即多重置换扩增）应用最为广泛。有研究报道WGA会导致微生物群落组成失真。然而，之前的比较是基于纳克级别模板量，目前尚不清楚更低模板量是否能从这种方法中获益。第二种是直接利用微量DNA构建文库。根据DNA片段化的方法不同，将微量建库试剂盒分为三类：机械法片段化（超声或雾化）、核酸内切酶片段化和Tn5转座酶片段化。值得注意的是，已有文章指出基于转座酶方法的起始模板量可低至100 fg。尽管已经有一些研究评估了上述一些方法在微量宏基因组建库中的效果，但每项研究中使用的文库构建方法和评估指标都非常有限，因此使用更新的技术（试剂盒）、进行更全面的评估仍然是必要的。

除了文库构建的技术问题外，在处理低生物量样品时，来自试剂和环境的污染微生物DNA是另一个挑战。污染微生物的比例可能超过内源性微生物，从而导致微生物群落组成失真和宏基因组研究的假阳性结果。目前有一些算法广泛用于识别污染微生物，包括（a）基于相对丰度的方法，即过滤低于特定相对丰度阈值的类群，或在真实样本和阴性对照中具有相似丰度的类群；（b）Decontam方法，即过滤丰度与DNA起始量负相关和（或）在阴性对照中比在真实样本中出现频率更高的分类群；（c）SourceTracker方法，即应用贝叶斯方法来估计源自特定污染源的序列比例。一些研究基于16S rDNA扩增子测序数据对上述方法进行了评估，结果表明没有一种方法能够完全去除微量样本中的污染物。然而，目前尚没有研究使用宏基因组数据对这些去污染算法进行系统比较，这些方法的表现在不同模板量和不同污染物特征的文库之间是否存在差异也不清楚。

在本研究中，作者使用精心设计了一种人工合成DNA材料（sequins）作为模板，它具有较广范围的GC含量和浓度梯度，能模拟微生物群落的多样性，并且与任何已知序列没有同源性。作者旨在评估不同文库制备方法和去污染算法的表现，为从微量样本中获得高效、高保真的宏基因组数据提供方法学参考。

- 实验设计 -

将sequins 进行梯度稀释以生成5000 pg、500 pg、50 pg、5 pg、0.5 pg DNA及阴性对照。将全部样品进行基于全基因组扩增（WGA）和非全基因组扩增（non-WGA）的方法进行文库构建。non-WGA方法根据模板片段化方法分为（1）超声片段化：Nugen Ovation Ultralow System V2 Kit (Son_N)和QIAGEN QIAseq Ultralow Input Library Kit (Son_Q)；（2）内切酶消化：NEBNext Ultra II FS DNA Library Prep Kit (End_N)和QIAGEN QIAseq FX DNA Library Kit (End_Q)；（3）转座酶片段化：Vazyme True Prep DNA Library Prep Kit (Tn5_V)。每个样本由两名实验人员独立进行技术重复。全部样本进行二代测序。将每个文库的数据分为sequins和污染两部分，分别用于文库制备方法和去污染算法的评估。

图1 实验设计

- 主要结果 -

1. WGA显著改变了微量样本的微生物组成

WGA显著增加了DNA模板量，与预期一致。然而与non-WGA文库相比，WGA文库中sequins所占的比例更低，非sequins序列（包括微生物污染、非微生物污染、未分类的序列）占比随着DNA含量降低而显著升高。除此之外，与non-WGA文库相比，WGA文库检测到的sequins组成与理论sequins组成的Jensen-Shannon距离（JSD）更大，每个sequins组分的质量与序列数之间的相关性更差，整体组成更加失真(图2a,b)。WGA之后，技术重复样本之间的Jensen-Shannon距离更大，表明基于WGA的方法可重复性更差。

有趣的是，作者发现DNA模板的片段长度与WGA富集偏差程度呈正相关(图2c)，表明模板DNA片段越长，WGA的扩增效率可能越高。痰液样本的纳米孔测序数据进一步支持了这一发现。WGA之后，鲍曼不动杆菌片段长度的中位数从323 bp上升到2703 bp，纹状体棒状杆菌片段长度的中位数从381 bp到3606 bp(图2d)；同时，DNA模板较长的纹状体棒状杆菌的相对丰度从15.2%增加到86.5%（图2e）。此外，作者还观测到WGA导致基因组覆盖不均匀以及对低GC含量偏好的现象，这与之前的文献报道一致。

总的来说，WGA的方法引入了大量污染，并且对微量样本的保真度较差，因此不适合用于微量样本的宏基因组学研究。

图2 WGA对微量DNA宏基因组分析的影响

a 测定的sequins组成与理论值之间的Jensen-Shannon距离。

b sequins组分的质量与序列数之间的相关性。

c sequins成分的丰度偏差程度与模板片段长度之间的相关性。

d 痰液样本纳米孔测序中，鲍曼不动杆菌和纹状体棒状杆菌的读长分布，基于WGA（右）和non-WGA（左）文库。

e 痰液样本中主要组成的相对丰度。

2.non-WGA的DNA文库制备方法评估

首先，模板量在500 pg和5000 pg时，所有方法sequins序列占比均高于90%（94.81-99.77%，中位数98.68%），但当模板量降低时，除Tn5_V外的其他方法获得的sequins序列占比都显著下降。当模板载量为0.5 pg时，Tn5_V、End_N、End_Q、Son_N和Son_Q中sequins的比例分别是93.7%、78.21%、66.29%、1.64%和0.06%（图3a）。第二，End_N和End_Q的文库转化率最高，接着是是Tn5_V、Son_N和Son_Q（图3b）。第三，基于超声的文库复杂性最低。此外，Tn5_V采用更严格的片段筛选策略导致所构建文库的插入片段显示出最佳分布，峰值范围为292-371 bp。相比之下，End_Q、End_N和Son_Q插入片段偏小（峰值分别为193–244 bp、143–210 bp、139–349 bp），而Son_N文库的插入片段偏长、方差偏大（范围181–634 bp，图S3a)。

为了测试各种non-WGA文库制备方法的保真度，作者计算了理论sequins组成和检测到物种组成（包括sequins和污染微生物）之间的JSD。基于核酸内切酶的方法与预期组成的差异最小，其次是基于转座酶的方法，而基于超声的方法在起始模板量低于50 pg时，偏差明显更高。在忽略污染微生物的影响、仅比较sequins的组成时，作者发现了类似的结果，除了Son_N的表现显著提高（图3d）。保真度可能与GC含量的偏好性有关，因为与理论GC分布相比，non-WGA方法的GC分布向较低GC方向移动，特别是转座酶法（图S3b）。此外，所有方法的偏好性与模板片段长度呈微弱正相关（p < 0.001，线性回归），其中基于转座酶方法的决定系数最高（R² = 0.14，图S3c）。同时，sequins组分的模板片段长度与GC含量之间没有相关性（p = 0.76），表明模板片段长度可能独立影响保真度。此外，随着起始DNA量的减少，所有方法的可重复性逐渐降低，基于内切酶和转座酶的方法比基于超声的方法可重复性更好（图3e）。

综合保真度、真实组分的比例和可重复性三个关键指标，发现当起始模板量为5000或500 pg时，除了基于转座酶的方法保真度略低外，其他方法的表现都很好；当模板量为50或5 pg时，基于内切酶的方法优于其他方法；当模板量为0.5 pg时，基于转座酶的方法和一种基于内切酶的方法(Enz_N)的表现优于另一种基于内切酶的方法(Enz_Q)，其次是基于超声的方法(图3f)。值得注意的是，在0.5 pg时，基于转座酶的方法获得的sequins序列占比显著高于其他方法，这表明它在生物量非常低的样品上具有优势。

图3 基于non-WGA的DNA文库制备方法的评估

a 原始数据的序列组成。

b 文库转化率。

c sequins序列的duplication比例。

d sequins理论组成与测定的物种组成（包括sequins和微生物污染物，左）或测定的sequins组成（右）之间的Jensen-Shannon距离。

e 技术重复之间的Jensen-Shannon距离。

f 基于三个关键参数的方法评估热图。

3.文库制备过程中引入的污染特征

随着起始模板量的减少，污染比例逐渐增加，当模板量为0.5 pg时，污染微生物的比例增加到3.06-45.97%（图3a）。PERMANOVA结果显示，文库制备试剂盒解释了36.4%的污染组成的差异，表明大部分污染物特征是试剂盒特异性的。出乎意料的是，在PERMANOVA结果中，模板量是第二个重要的解释因素（R² = 15.6%，p < 0.001），表明sequins中存在一些内源性污染微生物。作者发现大肠杆菌、伽马病毒、柠檬酸杆菌、乳杆菌病毒和志贺氏菌的相对丰度与模板量呈正相关（在至少四个试剂盒中p.adj < 0.05和R² > 0.55，线性回归，图S4b），表明它们主要来自sequins材料，因此在后续分析中将其过滤掉。过滤后PERMANOVA结果中模板量的解释度降低到8.7%（p < 0.001）。

基于超声的方法引入污染物的量最高，Son_Q为15.59 pg，Son_N为2.32 pg，而其他方法的污染物较少（End_N、End_Q和Tn5_V分别为0.05 pg、0.04 pg和0.01 pg，图4a)。模板量为500 pg和5000 pg时，每个试剂盒中最丰富的污染物的相对丰度低于0.06%（图4b，图S4c），表明当模板量很高时污染不是主要问题。随着模板量减少到0.5 pg，Son_N、Son_Q、Tn5_V、End_N和End_Q的最主要污染菌属的相对丰度分别增加到21.4%、14.2%、1.3%、1.4%和1.0%；当相对丰度过滤阈值设为0.1%时，剩余污染物的百分比分别为91.1%、87.1%、76.0%、65.9%和51.5%（图4b）。

PCoA分析显示，两个基于超声的方法（Son_N和Son_Q），End_Q、End_N和Tn5_V形成了四个不同的簇（PERMANOVA R² = 0.52，p < 0.001，图4c）。当模板量较高时，技术重复的污染成分之间的Jensen-Shannon距离增加，这表明随着污染比例降低，随机性更大（图4d）。作者在属水平检测到494个核心污染物，占污染微生物总量的89%以上（图4e，表S3）。其中110个污染物在之前的研究中已有报道。五个试剂盒共有63个核心污染物，占比55%以上。End_Q、Son_N、Tn5_V和End_N分别有120、24、21和12个试剂盒特异的污染物，而Son_Q没有试剂盒特异的污染物（图4e）。五个试剂盒筛选到32种高丰度污染物（至少在1个试剂盒的半数以上文库中相对丰度大于1%，图4f）。其中，许多污染物经常发现于土壤和水中，例如不动杆菌属、慢生根瘤菌属和甲基杆菌属。值得注意的是，也有一些污染物是存在于人体皮肤和粘膜中的共生微生物或潜在病原体，例如皮肤杆菌属、葡萄球菌属、棒状杆菌属、不动杆菌属、链球菌属和克雷伯氏菌，相对丰度高达20.4%、9.4%、4.1%、3.2%、1.8%和0.3%，这可能导致人体微生物组研究和病原体检测的结论出现错误。最后，作者发现污染微生物的基因组覆盖是随机的（图S4d），因此很难区分污染物和真实组分。

图4 文库制备引入的DNA污染物

a 每个试剂盒的污染DNA定量。

b 用不同丰度阈值进行数据过滤后，残存污染物在总污染物中的占比。虚线表示丰度最高的污染物的相对丰度。

c 基于污染组分间Jensen-Shannon距离的PcoA图。

d 技术重复的污染组分间的Jensen-Shannon距离。

e 核心污染物Venn图。

f 32个主要污染物热图，左侧指示微生物的常见生态位。

4.去污染算法能从高质量文库

获得真实微生物群落

作者使用了三种最广泛应用的去污染算法，包括过滤相对丰度低于阴性对照五倍或十倍的物种（5/10-fold-NC），decontam（frequency模式、prevalence模式、either模式）和SourceTracker方法。Decontam最佳阈值设定为在100%准确度的前提下获得最佳召回率的阈值。真阳性、假阴性、真阴性和假阳性分别定义为准确鉴定污染物、未被鉴定出的污染物、sequins鉴定为真实信号和sequins被错误的鉴定为污染。

对于Tn5_V、Enz_N和Enz_Q文库，它们的微生物污染物水平相对较低（低于总reads数的10%），使用decontam-either，decontam-frequency，5/10-fold等去污染之后的物种组成与理论sequins的Jensen-Shannon距离比较小（<0.05）,表明这些方法能够从污染的文库中获得真实微生物群落。5/10-NC的召回率接近1，而decontam-either，decontam-frequency的召回率随着模板量降低而显著降低，不过这些召回率下降导致的假阴性只引起了较小的保真度下降。

对于微生物污染较重的Son_Q和Son_N文库（占总reads的0.06-30.89%，中位数16.69%；0.06-45.97%，中位数6.86%，图3a），当模板量是500 pg和5000 pg时，Decontam-either, Decontam-frequency和5/10-foldNC去污染之后的物种组成与理论组成的Jensen-Shannon距离接近0。然而随着模板量的降低，三种去污染算法的效率显著下降，尽管这些方法的召回率依然很高。在这些去污染算法中，Decontam-either是最有效的去污染算法，接着是Decontam-frequency和5/10 fold-NC。作者还发现一个有趣的现象，尽管Son_N和Son_Q在模板量是0.5 pg时有相似的污染水平，去污染算法在前者中的表现更好，这可能是因为Son_N文库间的污染特征更一致。另外，尽管表现最好的Decontam-either能够从0.5 pg和5 pg的Son_Q文库中去除大于95.8%的污染，去污染之后的物种组成与理论组成的Jensen-Shannon距离依然差异巨大，说明了当前去污染算法的局限性。

此外，Decontam-prevalence和SourceTracker对大多数文库的去污效果不佳，这是由于它们召回率低以及部分文库中SourceTracker的精准度低（图5b，图S5f）。

图5 不同去污染算法的评估

- 结论+讨论 -

高效率、高保真和高可重复性的宏基因组数据对于研究低微生物载量的生态环境中的微生物群落至关重要。作者发现对微量样本直接建库的方法优于WGA的方法。在non-WGA的文库制备方法中，对于起始模板量分布较广的样本，作者建议使用基于核酸内切酶的方法。如果研究中的大多数样本的微生物载量低至0.5 pg，则建议使用基于转座酶的方法，因为它可以更高效地获得真实组分的数据，这与其基因组片段化和接头连接一步完成、DNA回收率高有关。此外，尽管目前有很多微量建库试剂盒是基于超声的方法，但在作者的评估中，模板量低于500 pg时，超声方法的表现相当差。作者认为这可能与超声方法所需的额外处理步骤过多、机械断裂本身会导致大量DNA损伤和丢失有关。

尽管合适的文库制备方法可以产生高比例的真实组分，但微生物污染是不可避免的，因此使用去污染算法是必要的，尤其是对于微量样本。作者推荐使用Decontam-either方法并结合适当的阈值。使用去污染算法之后，可以从污染占比低于总数据10%的文库中获得与真实微生物群落相近的高质量数据，但不能从含有大量和高度多样化污染物的文库中获得高质量数据。这强调了整合适当的实验和生物信息学方法的必要性，同时也强调了改进去污染算法的必要性。

作者创建了一个标准化的数据集，该数据集有明确的真实信号和污染物标签，和多样的污染物丰度和特征，这将有助于新的去污染算法的开发。作者发现了约500个污染微生物菌属，其中一半以上从未被报道过，因此进一步完善了常见污染物的参考清单。它还揭示了在不同试剂盒和实验室间的污染物是不同的。因此，每个实验室都应建立自己的污染物数据库，通过使用模拟微生物群落或DNA进行梯度稀释构建文库，并定期重复此过程，这对于监测污染物水平以及设置合适的去污染阈值都至关重要。

作者的研究为微量样本的宏基因组研究提供了方法选择的参考。在文库制备方面，对于模板DNA量分布比较广的样本，作者推荐基于内切酶的文库制备方法；对于大部分模板DNA量在0.5 pg左右的超微量样本，推荐使用基于转座酶的文库制备方法；在污染去除方面，推荐使用decontam-either算法，其中适当的阈值设置很重要。通过结合适当的文库制备方法和去污染算法，可以实现从微量样本中获得高质量的宏基因组数据。

参考文献

Wang, C., Zhang, L., Jiang, X. et al. Toward efficient and high-fidelity metagenomic data from sub-nanogram DNA: evaluation of library preparation and decontamination methods. BMC Biol 20, 225 (2022).

- 作者简介 -

通讯作者

中科院北京基因组研究所

（国家生物信息中心）

李明锟

研究员、博士生导师

李明锟，研究员、博士生导师，德国马普学会生物信息学博士。2018年进入研究所后在Am J Respir Crit Care Med、Cell Host Microbes、Clin Infect Dis、Nucleic Acids Res等期刊发表论文二十余篇，引用超过2000次。课题组主要研究方向为组学数据深度挖掘与算法开发，承担多项科技部重大专项、重点研发、自然科学基金、国际合作项目，目前主要在以下三个领域开展工作：

① 病原微生物的精准检测技术。开发基于高通量测序数据分析的微生物及病原微生物鉴定分析方法，建立快速、灵敏、准确的病原体筛查鉴定系统。

② 人体微生物组成与功能。研究人体微生物组在不同条件（疾病、环境）下变化规律，揭示其形成与变化的驱动力，通过大数据方法解析其与人体健康关联。

③ 智能化基因组变异演化分析技术。主要围绕新冠病毒基因组开展分子演化分析、人工智能预测，建立病原体流行规律及演化趋势分析预测体系。

第一作者

中科院北京基因组研究所

（国家生物信息中心）

王淳

博士研究生

研究方向：

临床样本微生物组检测方法优化及关键技术研发

中科院北京基因组研究所

（国家生物信息中心）

张莉

副研究员

张莉，副研究员，丹麦技术大学博士，中科院青年创新促进会会员，北京市科技新星。长期从事人体微生物组研究，近五年在Cell Host & Microbe、The ISME Journal 等杂志以（共同）第一作者/通讯作者发表论文7篇，引用超1500次。主持国家自然科学基金青年项目、北京市科技专项-科技新星项目。当前主要研究方向为：基于宏基因组的病原微生物诊断方法开发；膳食麸质影响肠道微生物组及健康的机制研究；基于机器学习的个体特异性血糖反应研究；组织/肿瘤微生物组。

- 李明锟组招聘启事 -

李明锟课题组现招聘研究实习员/助理研究员/特别研究助理各1名，详见http://www.big.ac.cn/rczp/yjzzp/202208/t20220819_6501516.html。有意者请将本人最新简历发送给limk@big.ac.cn，邮件主题为：应聘李明锟组XXX岗位。自本通知发布之日起，符合岗位要求者均可报名，招聘到适合人选为止。欢迎广大热爱科学研究事业的有志之士加入本研究组！

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