基于高通量测序开发甘蓝型油菜全基因组SSR标记

1.研究背景

甘蓝型油菜（Brassica napus L.）是重要的油料作物，基因组大小为1130 Mb，作为异源多倍体作物，油菜大而复杂的基因组限制其研究进展，为发展油菜产业和加快油菜遗传研究，利用分子技术从基因组水平进行研究很重要。

分子标记广泛应用于植物育种、遗传多样性和种质资源评价等研究方向，SNPs是基因组中较为丰富的变异类型，但是不能发现由于表型差异造成的全部基因组变异，选择和利用SSRs标记来发现基因组上的重要遗传变异是很重要的，SSRs标记具有共显性、高丰度、高变异、随机分布等特点，是植物研究中应用较为广泛的标记类型之一。本研究利用NGS技术开发了甘蓝型油菜全基因组SSR标记，并分析微卫星重复序列的频率和分布，随机选取100对SSR引物，对8个油菜品种进行PCR扩增验证。

“Huyou21”具有高油、低芥酸、低硫代葡萄糖苷的特点，本研究对“Huyou21”基因组测序并开发SSRs标记，包括 “Huyou21”的8个油菜品种对SSRs标记进行可靠性评价，并选择具有多态性的SSRs标记对78份油菜种质进行遗传多样性评价。

2.材料与方法

基因组总DNA提取：Plant Genomic DNA Kit (ZOMANBIO, China)

文库制备与上机测序：Roche 454 GS FLX + System

SSR标记搜索：MISA 程序

SSR标记检测：8% PAGE凝胶电泳、3730XL Genetic Analyzer、GeneMapper软件

遗传多样性计算：POPGENE 软件

3.结果与讨论

本研究利用NGS技术得到213,876条reads，序列全长58.8 Mb，从18,575条微卫星序列中得到21,523个 SSRs（表1），复合SSRs占11.4%，平均SSRs密度366.2 SSR/Mb。所有鉴定的SSRs中二核苷酸最丰富，占47.5%，单核苷酸占30.7%，三核苷酸占20.6%；这些SSR重复中，单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸的重复次数较多，其余重复次数不到2%（图1）。在所有motif类型中，A/T和AG/TC是单核苷酸和二核苷酸中最常见的motif，三核苷酸重复频率最高的是AAG/CTT(30.2%)，其次是AGG/CCT(28.6%)（表2）。

表1 油菜基因组序列特征分析

图1 油菜基因组中SSR类型的统计

表2 油菜基因组序列最丰富的SSR motifs统计

本研究共鉴定出8964对SSR引物，最多为单核苷酸(3,884，占43.3%)，其次是三核苷酸(2,399，占 26.8%) 和二核苷酸(1,921，占21.4%)。随机选择100个SSR标记检测引物扩增效率，94%的基因组SSR标记具有扩增特异性和可重复性，另外有43%的SSR标记在8份油菜材料中具有多态性。

选择78份油菜材料进行遗传多样性分析，Na（平均等位基因数）为2_{7个，Ne（有效等位基因数）为1.14}3.25个，78份材料中34个SSR标记的Na和Ne的平均值分别为3.59和2.09，Nei’s基因多样性指数分布从0.12到0.69，平均值为0.48，Ho（观测杂合度）和He（期望杂合度）分布范围分别为0到1.00和0.12到0.70，这些标记的Ho和He的平均值分别为0.54和0.49，杂合度和等位基因多态性比较表明，78份油菜种质具有丰富的遗传变异和较高的遗传多样性。

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