【评测】胚胎干细胞转染方法

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国际上比较认可的转染方法：核酸转染仪是将传统的电穿孔技术和专用的转染试剂结合起来的产物，针对不同的细胞类型，采用一套最理想的转染试剂和转染程序，以达到最理想的转染效率。核酸转染仪特别适用于转染原代细胞和难以转染的细胞系，如T细胞及PC-12细胞系等。它可以直接将DNA转染到细胞核内，由此实现了因受到细胞分裂限制而一直困扰人们的原代细胞的高效率转染。目前通过核酸转染仪，可以在肿瘤研究、免疫学、组织工程学及心血管疾病研究领域中轻而易举地获得大于90％的高效率基因转染率。该设备由两部分组成：专用转染设备及转染试剂。优点：操作简单，转染率高，细胞毒性小，血清存在情况下几乎不影响转染效率，很适合胚胎干细胞转染。缺点：设备昂贵，大陆地区实验室配备少。

用病毒载体转导：融合荧光蛋白序列、寡核苷酸序列、抗性基因序列，包装后转染，可用带抗性药物的筛选培养基筛选转导阳性的细胞。优点：转染效率高，效果稳定，检测方便，成本低。缺点：步骤复杂繁多，特别是转染前那部分。

流式分选会遇到一个现实问题：分选细胞得率比较低，目前并不看好。

1关于序列，需要设计的是一种带有荧光素标记的甲基化寡核苷酸，他本身不能编码任何蛋白质，也就是说没有融合荧光蛋白序列，该寡核苷酸的主要作用是与小鼠体内某个基因互补，导致该基因启动子甲基化，从而产生下调基因表达，在寡核苷酸上面标记荧光素目的就是看他是否转染入细胞内。

2胚胎干细胞蛮难转染的，电穿孔法等转染效率太低，很多寡核苷酸的转染办法都是用脂质体转染的，而且在血清存在情况下就会降低转染效率。

3.许多大型公司有专用干细胞培养血清。

4.关于细胞筛选：转染后阳性细胞分离主要依靠选择性培养基进行，然后采用有限稀释法逐步扩增细胞。转染后的细胞很珍贵，使用抗体标记进行分选可能干扰细胞的生长。这个阶段工作量很大，养几百孔细胞是费体力的工作，做过单克隆抗体的朋友应该深有体会。

5.关于后期检测：如果转入的核苷酸序列是特异性的，将来检测嵌合体的时候，针对导入的序列就可以。

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