Bisulfite Sequencing
全基因组重亚硫酸盐测序（whole genome bisulfite sequencing） 表观遗传学研究已经证实了特定基因区域的DNA甲基化修饰对于染色体构象、基因表达调控机制有着重要影响，而全基因组DNA甲基化研究将是表观基因组学最为关注的内容之一。
Bisulfite处理能够将基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U，进行PCR扩增后变成T，与原本具有甲基化修饰的C碱基区分开来，再结合 高通量测序 技术，可绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。
特定物种的高精确度甲基化修饰模式的分析，必将在表观基因组学研究中具有里程碑式的意义，并且为细胞分化、组织发育等基础机制研究，以及动植物育种、人类健康与疾病研究奠定基础。
技术优势：
■单碱基精确度：精确分析每一个C碱基的甲基化状态。
■里程碑式的研究：特定物种的表观基因组学研究的重要内容，适用于所有具有精确基因组图谱的物种。
实验流程：
● 基因组DNAA超声打断至100-500bp的片段
● DNA片段末端修复、3’端加A碱基，连接测序接头。
● 采用 EZ DNA Methylattion-Gold kit 进行 Bisulfite 处理
● 脱盐处理，PCR扩增后进行文库片段大小选择。
● 合格的文库用于上机测序。
1. Data Clean
测序结果进行去污染，去接头处理。根据测序产生的序列文件*.fq 统计read
长度，read数量，数据产量。
2. 标准信息分析
2.1 Bisulfite-seeq 序列与参考序列的比对
在信息分析过程中，首先将每一对reads中正链reads上的C碱基转换为T碱基，而反链 reads中的G碱基转换为A碱基。在此基础上使用SOAP软件，将reads与参考基因组序列进行比对，唯一比对reads将用于甲基化信息的分析。数据比对统计结果如下：
2.2 C碱基测序深度的累积分布
甲基化C碱基在基因组上的分布包含三种形式（CG, CHG和CHH，其中H代表A 或T或C碱基）。下述图表中反映了三种不同分布类型的C碱基的测序深度累积分布。其中横轴表示C碱基测序深度，纵轴表示一定测序深度下C碱基的累积比例( copynum <=1.5即uniquely mapped reads的判断标准之一)。
碱基测序深度的累积分布图
2.3 不同reads测序深度下的基因组覆盖度
横轴表示测序深度，纵轴表示特定测序深度下所对应的基因组覆盖度。
2.4 计算C碱基的甲基化水平
每一个甲基化C碱基的甲基化水平均按如下公式进行计算：100*reads/total reads（例如：CpG位点的甲基化率=100*支持CG甲基化的reads/支持甲基化的 reads+支持非甲基化的reads）全基因组平均甲基化水平反应了基因组甲基化图谱的总体特征。
Average methylation level for C, CG, CHG and CHH
|
Pattern |
C |
CG |
CHG |
CHH |
|
Mathylation level |
5.00 |
80.88 |
4.89 |
1.22 |
2.5 全基因组甲基化数据分布趋势
甲基化C碱基中CG, CHGG与CHH 的分布比例
不同分布类型的甲基化C位点在不同物种基因组中出现比例不同，因此，各类型mC( mCG、mCHG和mCHH ) 的位点数目，及其在全部mC的位点中所占的比例(例：mCHG所占比例= mCHG数目/mC的总数)，在一定程度上反映了特定物种的全基因组甲基化图谱的特征。
不同分布类型甲基化 C 的数量及比例
|
Pattern |
mCG |
mCHG |
mCHH |
|
Number |
1,409,380 |
4,890 |
47,583 |
|
Proportion |
96.41 |
0.33 |
3.25 |
此外，还统计如下数据：
● CG、CHG和CHH中的所有C的甲基化水平
● 各个染色体中CG、CHG和CHH中C的甲基化水平
● 统计不同基因区域内CG、CHG和CHH中C的甲基化水平
● 不同基因元件区域中CG、CHG和CHH中C的甲基化水平
● CHG、CHH中甲基化C附近的9bp序列的序列特征分析
2.6 全基因组DNA甲基化图谱
染色体水平的甲基化C碱基的密度分布
从染色体水平来描述甲基C碱基的的分布情况。蓝点表示以10kb的窗口统计甲基化C碱基的密度在染色体上的分布情况，光滑曲线则表示不同类型甲基化C碱基( G、CHG和CHH )的密度分布。
染色体上甲基化C密度分布
全基国组不同功能元件区域的甲基化水平分布
2.7差异性甲基化区域（DMR）分析
在两个样品基因组相同位置上寻找包含5个CG的窗口，用CG甲基化水平的差异来寻找甲基化有差异的区域。确定每条染色体上有差异的区域长度和有差异的基因，并对这些基因做 GO 聚类功能分析，以分析差异相关基因是否有明显的功能聚类，即是否针对性地调控行使某类功能。DMR分析须基于两个样品进行差异比较。
DMR相关基因的GO聚类分析
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