微米尺度单颗粒的高通量测序揭示高温厌氧消化体系中的电子介导的微生物相互作用

Article, 2023-

Environmental Science & Technology

DOI: 10.1021/acs.est.2c08833

原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.est.2c08833

第一作者：Bixi Zhao (赵碧溪); Liming Chen (陈立明)

通讯作者：Yu Xia (夏雨)

合作作者：Miao Zhang (张淼); Cailong Nie (聂采龙); Qing Yang(杨青); Kaiqiang Yu(于凯强)

主要单位：南方科技大学环境科学与工程学院 (School of Environmental Science and Engineering, College of Engineering, Southern University of Science and Technology)

- 摘要 -

尽管导电材料已被证明能够通过改变微生物间的相互作用来提高厌氧消化(AD)的效率，但在高温条件下的相互作用关系尚未被研究。为了确定高温厌氧消化(TAD)微生物组中真正的物种-物种之间的关联，以及揭示碳布(CC)添加的影响，我们从实验室规模的高温厌氧消化反应器中随机分离了微米级(40-70 μm)的单颗粒。结果表明，添加碳布不仅显著提高了甲烷产量，还增加了基质中群落的空间异质性。加入碳布后，Pseudomonadaceae明显从基质向生物膜转移，表现出显著的生物膜形成能力。此外，Clostridium和Thermotogaceae在TAD菌群的基质和生物膜中紧密聚集并稳定共存，这可能与它们独特的胞外糖代谢方式有关。最后，还发现了Syntrophomonas与反硝化菌Rhodocyclaceae之间的相互作用, 在这些物种的细胞膜上，呼吸相关电子转移基因(cystic -c, complex III)的上调表明了反硝化途径与通过直接种间电子转移(DIET)的乙酸盐氧化的潜在耦合。这些发现为导电材料如何促进高温消化性能提供了见解，并为改善生物处理系统的群落监测开辟了道路。

- 引言 -

有机废物是人类活动不可避免的结果。厌氧消化(AD)可以消耗有机废物，产生清洁能源，被认为是实现可持续社会的重要途径之一。在厌氧消化过程中，温度是影响消化速率的重要因素。研究人员曾报道，在处理厨余垃圾时，高温厌氧消化(TAD)在甲烷产量方面优于中温反应器，这凸显了传统厌氧消化工艺的实用改造的潜力。

温度等操作参数主要通过影响微生物群落的多样性和活性来影响厌氧消化性能，厌氧消化系统的稳定性和效率很大程度上取决于微生物的相互作用。例如，产氢产乙酸菌(如Tepidoanaerobacter sp.和Coprothermobacter sp.)和产甲烷古菌(如Methanosarcina sp.)之间的协作被报道为厌氧消化产甲烷的驱动机制。此外，电子交换在甲烷生成过程中很重要，这已逐渐成为普遍共识，大量甲烷菌已显示出直接通过电子或间接通过导电材料从电子供体微生物直接接受电子的能力。因此，通过添加导电材料或施加外电场来刺激种间电子交换已被用于促进处理不同底物的厌氧消化系统的甲烷生成。然而，目前，添加导电材料在高温条件下促进甲烷生成的有效性还从未被评估过，而且支持这种性能增强的电子交换相互作用尚不清楚。

目前，大多数微生物相互作用的推断是基于遗传学。为了从组学数据中预测相互作用网络，已经开发了几种网络构建方法。然而，之前通过共现网络进行的相互作用推断受到了样本规模的限制，以往的样本规模超过了数千个真正发生了物种-物种相互作用的微小群落。因此，从这种宏观规模的数据预测的物种之间的相互作用更有可能反映非生物学特征(如温度或pH)的响应，而不是生物学关系。由于相互作用衍生的空间尺度通常<100 μm，因此研究微米尺度空间群落组织内的跨物种相互作用具有特殊的价值。已经有一些研究聚焦于这种微米尺度的群落，以揭示微生物群落可能的相互作用结构，例如土壤，海水和人体肠道微生物群落。然而，厌氧消化过程中微生物之间的相互作用从未在微米尺度上被阐明，并且我们对高温厌氧消化系统中微生物与导电材料之间的相互作用知之甚少。

综上所述，在本研究中，为了更深入地了解高温厌氧消化系统群落中电子介导微生物之间的相互作用，我们用导电碳布(以下简称CC)来刺激厌氧消化体系中的甲烷生成。在添加CC和对照反应器中，分别从悬浮基质和CC附着生物膜上的微颗粒进行随机取样。采用空间关联共现网络分析推断微米尺度下微生物间的相互作用，并对构建的网络进行比较，揭示TAD群落内电子相互作用以及内在的协同关系。此外，基于宏基因组学和宏转录组学，结合荧光原位杂交(FISH)和qPCR验证，我们解释了代谢潜能和相互作用物种之间的转录活性。我们的发现将有助于更好地理解导电材料强化高温厌氧消化系统微生物组的甲烷生成，并将展示微米尺度群落内微生物相互作用。

- 结果 -

① 通过添加CC促进TAD的产甲烷性能

Promoted methanogenesis performance in TAD by CC addition

图2. 添加导电碳布（CC）前后的高温（55°C）厌氧消化器的性能。图（a）显示了反应器运行阶段的甲烷产率，加上虚线表示第二阶段的平均产率值。图（b）是一个箱线图，显示了CC和CK反应器在不同阶段的甲烷产量比较。图（c）显示了参与甲烷生成途径的基因的整体转录活性。图（d）显示了CK-M和CC-M之间绝对生物量密度（以16S rRNA基因拷贝数计）的比较。

CC组甲烷产率为29.08 ± 5.42 mmol （g·VSS）-1，对照组23.2±4.9 mmol（g·VSS）-1。值得注意的是，CC组中参与甲烷生成途径的基因的总转录活性明显高于CK组（图2c），这意味着导电材料的添加促进了整体群落转录稳定性。此外，与CK-M相比，CC-M和CC-B产甲烷菌的转录活性分别提高了43.4%和39.2%，凸显了导电介质对产甲烷途径的影响。同时，qPCR分析还证明，CC反应器的基质中，基于的16S rRNA基因拷贝数生物量显著高于CK反应器（图2d）。如图S6所示，在CC组中观察到更温和的VFA（挥发性脂肪酸）积累，表明其中VFA转化为甲烷的速度更快。添加CC可以作为产氢产乙酸菌和产甲烷菌之间的导电介质，确保TAD微生物组中的酸转化。综上所述，在TAD群落中观察到的由于添加CC所增加的甲烷产量可归因于总生物量的增加及DIET相关产甲烷途径的转录活性升高。

② 添加CC后TAD中基于微米尺度颗粒的

空间异质性与群落聚类

Spatial heterogeneity and community clustering of TAD consortia with CC addition based on micron-scale flocs

图3. （a） 主坐标分析，预测不同群体微颗粒之间的群落差异。图中的每个点代表一个颗粒，紫色、黄色和绿色分别代表 CC-B、CC-M 和 CK-M 组。等高线显示了 PC1 和 PC2 空间中的二维核密度估计值。灰色箭头线表示前十个最可变系列的变化方向，线的长度表示 PC1 和 PC2 解释的变化量。图中显示了不同样品组微颗粒之间的群落变异系数。下面的条形图显示了这些物种的估计贡献，其名称与PCoA图中显示的数字相对应。（b） 每个颗粒的群落组成。分别来自CC和CK反应器自由生活污泥介质的73个和78个（40-70微米）单个絮凝体，来自附着在CC反应器中添加的碳布生物膜上的117个颗粒。

为了比较群落变化并揭示TAD群落的空间异质性，我们通过从颗粒之间的平均Bray-Curtis距离以及反应器内不同颗粒中物种的变异系数来衡量的空间异质性。平均Bray-Curtis距离越高，空间异质性越大。单个颗粒的群落组成如图3b所示。

在主成分分析（PCA，图3a）中，在CC反应器中观察到的生物膜和基质的群落之间的清晰聚类（Wilcoxon测试，P < 0.01）表明，采用附着生长的微生物与游离生活方式之间存在明显的系统发育差异。此外，与基质（CC-M）相比，从生物膜（CC-B）中分离的微米级单个颗粒表现出较低的空间异质性水平，这可能与基于选择或生态位驱动过程的特定细菌基团选择性附着在生物膜上有关。此外，与基质（CC-M）相比，从生物膜（CC-B）中分离的微米级单个颗粒显示出显着较低的Bray-Curtis距离，为0.18（ANOSIM Test， P < 0.01）。

此外，在TAD系统的污泥介质中也观察到添加导电材料的明显影响，即CC反应器介质中微颗粒的群落组成与CK反应器中的群落组成不同（Wilcoxon测试，P < 0.01，图3a）。在CC反应器的介质中，具有非常广泛的芳香族化合物代谢能力的鞘杆菌科的增量对CC和CK絮凝体之间的分离显示出最高的估计贡献。与CK反应器相比，CC反应器介质中的空间群落异质性显著增加，变异系数高达0.381（ANOSIM检验，P < 0.01）。由插入碳布引起的营养物质分布不均可能是导致群落同质性降低的一个因素。随机选择的单个颗粒中不同物种相对丰度的变化如图4所示。

③ 基于微米尺度单颗粒的

空间关联共生网络分析 

Spatial association co-occurrence network analysis based on micron-scale single flocs

通过网络分析探索微米尺度的共生模式，以揭示CC添加前后微生物组内的种间相互作用（图6a）。通过分析大量微米级颗粒的TAD群落的空间保守共生关系，我们观察到Clostridium和Thermotogaceae在CC-M，CC-B和CK-M的所有样品组中均表现出稳定的共生（图6a）。为了进一步验证这两个种群之间的共生关系，使用Clostridiales（Clo549，洋红色）和Thermotogales（Ttoga660，绿色）的FISH特异性探针来确定它们的空间分布。在所有情况下，洋红色似乎都与绿色种群定植（图6b），证实了这些种群在微米尺度下的空间连接。在三个采样组的共现性网络中，仅观察到一种互养单胞菌的合养细菌（图6a），并且在导电碳布的生物膜上观察到互养单胞菌与反硝化菌之间的耦合。互养单胞菌在短链脂肪酸的氧化中起着至关重要的作用，并且通常报告与产甲烷菌同时出现。然而，我们没有检测到合成单胞菌和产甲烷菌之间的统计学支持相关性，可能是由于缺乏覆盖嗜热古菌种群的通用引物。

- 讨论 -

① 微米尺度群落揭示了

添加CC的TAD体系的空间异质性

Micron-scale community revealed spatial heterogeneity of TAD consortia with CC addition

图4. 不同反应器微颗粒中前40个科的变化。突出显示的圆圈显示了所有颗粒的平均相对丰度，紫色、黄色和绿色分别代表 CC-B、CC-M 和 CK-M 反应器。灰点表示每个颗粒每个科的相对丰度。右侧的条形显示变异系数（标准差除以平均值）。

大多数多物种微生物群落在空间上是有组织的，并且在微观尺度上表现出明显的变化。因此，了解空间异质性可能有助于在适当的规模下更清晰、更准确地理解TAD系统中的微生物相互作用。对随机选择的单个颗粒中不同物种的丰度变化进行了分析，以显示它们在样本中的空间异质性（图3b）。产甲烷菌是在不同TAD反应器的污泥介质和生物膜中收集的微颗粒中流行率变化程度最高的物种之一（图4，产甲烷菌的标签为红色字体）。产甲烷菌的这种异质分布表明，在良好控制和良好混合的条件下，生物相互作用在决定产甲烷种群的组装中起着重要作用。

② 基于微米尺度单颗粒的空间关联共生网络

揭示了不同的种间合作

Spatial association co-occurrence network based on micron-scale single flocs revealed different inter-species collaborations

图 6.（a）基于从CK-M（左）、CC-M（中）和CC-B（右）中的微颗粒构建的空间关联共现网络。相关性分析是根据科一级的群落组成进行的。如果一个科只包含单个主要子谱系，我们用子谱系的名称标记节点。边代表相关性（斯皮尔曼ρ > 0.6）和显著性（P < 0.01）。对于每个共现性网络，每个节点的大小与连接数成正比；两个节点之间每个连接的粗细与斯皮尔曼相关系数的值成正比。（b）左图显示了Thermotogaceae和Clostridium的细胞结构和糖代谢过程，右图是FISH显微照片，其中Clostridium（Clo549）是洋红色，Thermotogaceae（Ttoga660）为绿色，而DAPI（蓝色）组合用于染色所有古菌和细菌。（c）Syntrophomonas 和 Rhodoclyclaceae之间的电子传递（即DIET）途径示意图。红色箭头说明了电子转移的潜在路径。蓝色线表示Rhodoclyclaceae的反硝化路径，而绿线表示Syntrophomonas中乙酸盐氧化。热图显示了途径内各个步骤的基因丰度（log2 RPKM-DNA）和转录活性（log2 RPKM-RNA）。右侧的条形图显示了这两个群体中IET相关基因的RT-qPCR结果。将不同特定设计引物的平均Ct值与16S rRNA基因的平均Ct值归一化以获得∆ Ct。

共现性网络分析揭示了添加CC前后TAD微生物种间相互作用（图6a）。网络拓扑结构更加复杂，加上基因的整体转录活性增加（图2d），表明微生物相互作用在生物膜上更加复杂和活跃。由于AD系统的产甲烷作用涉及水解、酸化以及合成产甲烷伙伴之间的一系列种间合作，因此相互关联的生物膜微生物组也可能有助于促进CC反应器中的产甲烷性能。

Clostridium主要利用难以消化的多糖，因此通常充当AD群落中的重要水解剂之一。在我们的TAD系统中，Clostridium在水解各种碳水化合物方面也表现出明显的代谢潜力以及关键基因的转录活性（图S8和图S9）。值得注意的是，Clostridium和Thermotogaceae之间的保守共生可能在于它们细胞外糖代谢的相互方式（图6b）。梭状芽胞杆菌以纤维素复合物的产生而闻名。而Thermotogaceae的共同形态特征是存在外鞘状包膜（“toga”）。toga在Thermotoga细胞的细胞末端，扩大了加有解聚酶用于糖捕获的表面积。通过类比，我们推断Thermotogaceae独特的细胞外“toga”使它们能够通过有效地消耗中间代谢物（图6b）在Clostridium周围形成一个合适的生态位，这反过来可以为Clostridium的水解反应提供热力学有利条件，Clostridium在代谢高温消化中水解释放的单糖方面表现出代谢能力。

通过宏基因组获得的基因组信息表明，Syntrophomonas和Rhodoclyclaceae之间的氧化还原介导的电子转移可以由各种c-Cyts特化细胞色素蛋白介导，这些细胞色素蛋白允许电子转移到其他电子受体。尽管在Rhodoclyclaceae的组装基因组中鉴定出该电子摄取途径的完整基因集，但RNA-seq无法检测到转录活性（图6c），可能是由于RNA提取偏差。此后，通过RT-qPCR进一步测量相关基因的转录活性（图6c）。结果显示，在所有样品中，Rhodoclyclaceae中IET相关基因的转录水平相对一致，这意味着活跃的外部电子导入过程与反硝化相结合时，可能有助于Rhodoclyclaceae在群落中的占据有利生态位。

结果表明，添加碳布后，TAD反应器的产甲烷效率有所提高，这可能是由于TAD微生物组中参与产甲烷途径的生物量和基因转录总体增加。此外，通过对随机收集的微米级颗粒进行大规模群落剖析，结果表明，碳布的插入明显改变了TAD反应器中微米尺度群落组成，增加了污泥基质的空间异质性。进一步的相关性分析显示Clostridium和Thermotogales之间胞外糖代谢存在保守互作，而在附着在碳布上的生物膜上观察到Syntrophomonas和Rhodoclyclaceae之间的IET相关互作耦合。这项研究举例说明了微米级群落研究在阐明微生物机制方面的效用，这对AD系统的稳定性和效率至关重要。因此，为未来工程微生物系统中种间竞争、共生的微生物生态学研究铺平了道路。

参考文献

Bixi Zhao, Liming Chen, Miao Zhang, Cailong Nie, Qing Yang, Kaiqiang Yu, and Yu Xia*. (2023) Electric-Inducive Microbial Interactions in a Thermophilic Anaerobic Digester Revealed by High-Throughput Sequencing of Micron-Scale Single Flocs. Environmental Science & Technology, https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.est.2c08833

- 第一作者介绍 -

第一作者：赵碧溪，南方科技大学环境科学与工程学院夏雨课题组在读博士生。主要关注厌氧消化过程中的共生菌（Syntrophs）产甲烷机制，厌氧微生物群落中的胞外电子传递（DIET及EET）菌群的鉴定和生态功能。

共同第一作者：陈立明，2019年毕业于北京大学，现为南方科技大学环境科学与工程学院研究助理教授。主要关注人工系统中厌氧氨氧化（Anammox）菌群的活性、代谢和相互作用机制，以及自然生态系统中Anammox菌群的多样性和群落构建机制。

- 通讯作者介绍 -

南方科技大学环境科学与工程学院

夏 雨

副研究员，博士生导师

夏雨：夏雨博士，香港大学水资源与环境工程博士。现任南方科技大学环境科学与工程学院副研究员（博士生导师），环境微生物与生态基因组学实验室负责人。研究兴趣集中于：结BONCAT, Single-cell，DNA-SIP等先进分子生物学手段、以Nanopore测序为代表的单分子高通量测序技术以及生物信息学大数据分析，解密生物处理反应器、极端自然系统及洁净室内环境中微生物群系的群落构建原理、功能调控机制以及关键基因（耐药基因）水平转移规律。近五年来在The ISME Journal, Microbiome, Environmental Science & Technology, Water Research 等顶级期刊发表论文40余篇，总引用次数 2900余次（Google Scholar）。现任中国工程院院刊Engineering青年通讯专家、iMeta期刊执行副主编。应邀在国际会议做报告20余次，1次担任分会主席，1次大会报告；曾担任南方科技大学教授委员会环境科学与工程学院代表委员，美国微生物协会香港地区青年大使。

Dr Yu XIA, PI of the Environmental Microbiology and Ecogenomics Laboratory at School of Environmental Science and Engineering, Southern University of Science and Technology (SUSTech), Shenzhen, China. Dr Yu XIA got her PhD on Environmental Microbiology from The University of Hong Kong. She is interested in applying advanced sequencing and molecular technology such as long-read based metagenomics, microfluidics and single-cell to explore the functionality of the unculturable majority of environmental microbiome in engineered systems, indoor environments and extreme environments.