最简单直接粗暴的Mothur分析OTU教程

2024-04-18 13:40:28

最简单直接粗暴的Mothur分析OTU教程

废话不多说，首先你需要下载Mothur，直接百度去官网下载

第一步：准备需要分析OTU的序列文件（fasta格式）

一般通过载体连接、大肠杆菌克隆、测序得到的16S rRNA序列两侧是有引物的，不管你用的是不是1492r和27f。在这一步你需要做的事是：

1. 把所有序列放在一个fasta文件夹中；

2. Align一下让它们对齐（Bioedit、MEGA随便什么可以align的软件随你用）（虽然Mothur也可以用来对齐但是非常TM不好用，直接用别的软件更加直观！）

3. 保证它们的方向一致

（方向不一致即使你两条序列相似性99%Mothur也会把它们分到不同的OTU）
（直接align完以后看一下序列两端引物是不是同一个，不是就直接Reverse Complement）
（reverse complement以后就会发现序列首尾都是引物了，要是对的不齐就再align一下）
（完事了输出fasta格式的序列文件，这就算准备好了）

第二步：计算OTU

1. 把你准备的fasta文件放到mothur.exe所在的文件夹下，双击mothur.exe

2. 运行指令dist.seqs(fasta=example.fasta,cutoff=0.03,output=square)，输出 example.square.dist文件

这一步是要计算距离矩阵，fasta就是你的序列文件，cutoff是OTU分类的阈值（0.03意味着相似性大于97%是一个OTU），output是输出距离矩阵的形状（square是矩形，还可以是三角形）
这一步其实还可以设置其他的参数包括罚分方式、计算方式等，但是默认的其实就可以了，如果你有特殊要求自己去Mothur官网看。

3. 运行指令cluster(phylip=example.square.dist,cutoff=0.03)，输出文件example.square.opti_mcc.list文件

这一步是将距离矩阵聚类，可以选择method，默认是furthest，有特殊需要自己去看官网

4. 运行指令bin.seqs(list=example.square.opti_mcc.list,fasta=example.fasta)，输出example.square.opti_mcc.0.03.fasta

用记事本打开这个fasta文件就看到OTU已经分好了

5. 运行get.oturep(phylip=example.square.dist,list=example.square.opti_mcc.list)，输出example.square.opti_mcc.0.03.rep.names

这个步骤就是把每个OTU的代表序列挑选出来
最左侧是每个OTU的代表序列名称，右侧是对应的OTU内包含的所有序列名称

（自学的，不对的地方可以友好交流，一起进步，靴靴）

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