需要用到的软件

MAFFT：多重比对，conda下可以直接安装；也可以通过在线网站https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/
AliView：可视化比对结果，http://www.ormbunkar.se/aliview/
BMGE：用于移除比对效果差的区域，conda下直接安装

MAFFT多重比对和Aliview的可视化

下面介绍command lind 和 online两种方法。

command

mafft --auto seqence.fasta > sequence_aln.fasta--auto表示自动选择算法

online

在网站上选择上传你的fasta文件或者复制到选框中，其他选项暂时保持默认。点击最下方的submit。

结果

无论哪种方法，在选择--auto时，都会报告出多重比对使用的算法：

点击上方的‘Fasta format’进行下载。

补充

前面我们使用的是自动选择算法并保持参数默认。此时的空位罚分是1.53，软件会选择合适的算法，但是不能够自己修改参数，如果需要更好的比对效果，需要自己定义空位罚分，下面我们设定罚分为2。（如果图省事可以使用默认的参数）

mafft --auto --op 2 seq.fasta > seq_op2_aln.fasta

将两个比对结果用Aliview可视化结果如下：

op=1.53

op=2

从图上我们看到，比对长度不一致，当罚分增加时，gap会变少。这符合生物进化规律，基因突变的概率总是比从获得一段外源基因高。

Aliview纠正比对结果

图上可以看到 1020-1040 这一段比对结果并不理想，很明显不符合实际情况。

我们选择这一段区域，点击‘Align’ - ‘Realign selected block’

似乎规律了一些，但是我们分析时还是需要考虑这一段是否是我们分析所需要的，有没有必要剔除。

BMGE过滤修剪多重比对结果

多重比对对齐包含高变异和保守区域。因此，在基因的某些部分中，核苷酸的同源性很明显，但在其他部位中变异度非常高。为了避免在下游系统发育分析中对比对误差产生的问题，我们将基于gap的比例和这些区域内发现的遗传变异来识别不良的区域，我们将从比对结果中排除它们。

bmgen -i seq_aln.fasta -t DNA -of seq_filtered.fasta -oh seq_filtered.html

当我们增加gap的比例时，BMGE会选择更多的区域

bmgen -i seq_aln.fasta -t DNA -g 0.3  -of seq_filtered.fasta -oh seq_filtered.html

基于密码子的手动对齐

同样的，先经过MAFFT的多重比对。
接下来便交给Aliview
下图是核苷酸序列经过多重比对的结果

我们使用工具栏的第四个图标将核苷酸转换成氨基酸：

接着点击Sigma图表计算终止密码子数目，发现有三个终止密码子。
我们依次点击sigma旁边的按钮选择比对结果最好的一个。
接着，删除首尾区域，首位不对齐主要原因并不是因为生物分化巨大，而是由于数据缺失。
之后我们检查中间区段是否有大量gap存在，进行手工删除。
至此，我们便得到了较为准确的多重比对结果。

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