Velvet简单介绍：

velvet是一款常用的基因组拼接软件，与soapdenovo一起常用于二代测序数据的处理，相对于soapdenovo拼接的完整性更好。他能同时支持fasta、fastq格式的数据，同时支持多个文库的数据同时使用。

其工作的一般过程简化为：输入short read序列，排除错误，产生高质量的contigs。然后用paired-end read和long read信息，检索contigs之间的重复区域。

Velvet工作原理：

1、Bruijn算法

给定的数据总是存在着冗余信息，因此，算法的使用很重要。当前大多数是用的overlap-consensus-layout算法，它的每一个 read都是单独的实体。而Bruijn算法，将分析基于observed words（或者k-mers）。给定k-mers，不管发现多少次，都是唯一的node。此外，他可以无差别的容纳long和short read的混合物。

构建Bruijn图关键在于对所有的reads进行hash。Hash值通过设置参数给定，或者是默认的21。这对所有的序列进行成对比对时会减少 时间，一旦所有的reads已经被hash，由k-mer node可以追溯他们的每一个路径。增值覆盖率和创建arcs就属于这种方法。

2、错误移除

错误移除算法：Tour Bus，对没有错误连接的graph进行移除。这要确保基因组中低覆盖率的唯一的点没有被破坏。因此，这一步在画图之后进行。

错误的类型主要有：

• Tips：起源于低质量的read的结尾部分没有任何的重叠。
• Bubbles：他产生于长read的中间或两个错误的read结尾部分重叠。

首先去除tips，由长度和覆盖率来定义。然后去除bubbles，运用的是与Dijkstra’s类似的算法，最后低覆盖率的点会被去掉。

使用方法

在前面的文章中已经介绍了velvet的安装方法（）。

1.准备输入数据

无论是fasta格式的数据还是fastq格式数据，首先利用velvet自带的两个脚本程序对每一个pair-end数据进行合并；方法如下：

对于fasta格式数据

shuffleSequences_fasta.pl s1_1.fasta s1_2.fasta s1.fasta

最后的得到的数据格式如下（成对的正反向reads连续放在一起）：

>2:1:3789:2197:Y/1

CAGACTAATACCAATCCAACCCATTTCATGAATAAAATGTGACCAATTAACCAACCAACAAAACTGCTTGTTACAAATAA

>2:1:3789:2197:Y/2

ATACAATAACTGTACTAGCTCTACCGTATCTTTTGTTTCATTTCTTCTGGAATAATCACAAAAACTTTTTTGATTATGGA

>2:1:4209:2183:Y/1

TTATAGAAAAGAAAGAAAAGAATGAAAAATAAAGTAATTTTTGATTGGGCCGGGAATCCTATTTTGGATTCGGTATGGAT

>2:1:4209:2183:Y/2

ATCTTTCGCCTATAAATTCAATGAATGAATTACCTCTCAATGATCTTGAATCGGATCAAGATCATGAATAACAATATCTG

>2:1:6191:2192:Y/1

AAAGCATTCACTCCTCTTTTATATCTTGCATCTCTAGTATTTTTGCCCTGGTGGATTTCTCTTTCATTTAATAAAAGTCT

>2:1:6191:2192:Y/2

ATTCCTATACGAAGGTTTTGTAGATGTGTCTCCGAGTATTCCTTGATCATTTCCTCCAAGGGAAGGATTTCCTCTAATTC

对于fastq格式数据

shuffleSequences_fastq.pl s1_1.fq s1_2.fq s1.fq

得到的数据格式与上面类似，只是数据是fastq格式而已，以上得到的s1.fasta或s1.fq可以直接被后续使用。

2.格式化reads

Velveth用一些序列文件产生一个hashtable，并输出两个文件：Sequences和Roadmaps。一般使用以下命令即可，蓝色标记的部分可以重复，即当你有多个文库的时候都按照蓝色部分的格式来写

./velveth directory hash_length { [-file_format] [-read_type] [filename] } [options]

directory：输出文件所在路径的名字（即创建一个文件夹存放结果文件）

hash_length：也叫k-mer length，默认为31bp，储存hash length，值越大，内存需求越大

filename：标准输入文件名

Options:

-strand_specific：转录组序列数据，默认为off

支持的文件格式：fasta，fastq，fasta.gz，fastq.gz，eland，gerald。默认为fasta

读类别：short，shortPaired，short2，shortPaired2，long，longPaired。默认为short

例子1：

> ./velveth output_directory/ 21 –fasta –short solexa1.fa solexa2.fa solexa3.fa –long capillary.fa ；

默认参数为fasta、short，因此可以写成：

>./velveth output_directory/ 21 solexa*.fa –long capillary.fa

例子2：

假如你用一个标准的转录组序列来做，为使结果更好，可用一下选项（-strand_specific）。

> ./velveth output_directory/ 21 (...data files...) -strand_specific

3.序列组装

Velvetg是velvet的核心，他建立bruijn图并对reads进行组装。

./velvetg directory [options]

directory：工作路径名

Standard options：

-cov_cutoff <floating-point|auto>：移除低覆盖率的node，默认不移除

-ins_length <integer>：two paired end reads之间的期望距离，默认no read pairing

-read_trkg <yes|no>：在集合中对short read位置进行跟踪，默认不跟踪

-min_contig_lgth <int>：导出到contig.fa文件中的最小contig长度，默认为hash长度的2倍

-amos_file <yes|no>：导出到AMOS文件中，默认不导出（no）

-exp_cov <floating point|auto>：唯一区域的期望覆盖率

Advanced options:

-ins_length2 <int>：两个paired-end reads在第二个short-read数据集中的期望距离，默认否

-ins_length_long <integer>：两个long paired-end reads的期望距离，默认否

-ins_length*_sd <int>：数据集的标准差，默认corresponding length的10%（*代表：nothing，2，_long）

-scaffolding <yes|no>：scaffolding of contigs used paired end information (default: on)
-max_branch_length <integer>：在bubble中的碱基对的最大长度，默认100

-max_pergence <floating-point>：在一个bubble中的两个分支的最大分歧率，默认0.2
-max_gap_count <integer>：在一个bubble中的两个分支比对中允许的最大gap值，默认3

-min_pair_count <integer>：构成两个长contigs的paired end的最小值，默认10

-max_coverage <floating point>：在tour bus后移除高覆盖率的node

-long_mult_cutoff <int>：合并contig的long reads的最小值，默认2

-unused_reads <yes|no>：将不用的reads导出到UnusedReads.fa文件中，默认否

-alignments <yes|no>：导出一个主要的contig并和参照序列对其，默认否

例子3、

设置覆盖截断值：

> ./velvetg output_directory/ -cov_cutoff 5.2

排除最高的覆盖数据，设置最大覆盖截断值：

> ./velvetg output_directory/ -max_coverage 300 (... other parameters ...)

自动设置覆盖截断值：

> ./velvetg output_directory/ -cov_cutoff auto

例子4、

如果你有一个足够覆盖面的短read，有任意数量的长read，你可以用长read做repeat。为了达到他，velvet需要对短read的序列有一个期望覆盖的适当的估计。简单的方法是重叠群被发现的分布，也要看覆盖点的聚类情况。如果期望覆盖是19x：

> ./velvetg output_directory/ -exp_cov 19 (... other parameters ...)

假如你有理由相信合理的统一的覆盖你的sample，你可以要求velvet估计他：

> ./velvetg output_directory/ -exp_cov auto (... other parameters ...)

例子5：

Minimum long read connection cuto?：对于用long reads拼接完成contigs，需要设置一个阈值来减少误差（默认为2）。假如你的长序列没有与之重叠的序列（例如contigs），你可以设为0， 对他直接进行使用。相反的，如果你的长序列覆盖范围很高，就需要设一个高的阈值。

Minimum read-pair validation：假如你的数据不是paired-end reads，只是偶然成对，那么为减少误差，就需要你在对两个contigs进行拼接时至少要有10对pairs（默认）。

> ./velvetg output_directory/ -min_pair_count 20 (...other parameters...)