虽然高通量测序分析最常用的操作是将fastq比对到参考基因组得到BAM文件，但偶尔我们也需要提取BAM文件中特定区域中fastq。最开始我认为这是一个非常简单的操作，因为samtools其实已经提供了相应的工具samtools fastq.

以biostar handbook的Ebola病毒数据为例，首先获取比对得到的BAM文件。

# 建立文件夹

mkdir -p refs

# 根据Accession下载

ACC=AF086833

REF=refs/$ACC.fa

efetch -db=nuccore -format=fasta -id=$ACC | seqret -filter -sid $ACC > $REF

bwa index $REF

SRR=SRR1553500

fastq-dump -X 100000 --split-files $SRR

BAM=$SRR.bam

R1=${SRR}_1.fastq

R2=${SRR}_2.fastq

TAG="@RG\tID:$SRR\tSM:$SRR\tLB:$SRR"

bwa mem -R $TAG $REF $R1 $R2 | samtools sort > $BAM

samtools index $BAM

让我们尝试提取下前1kb比对的fastq文件

samtools view -h SRR1553500.bam KJ660346.1:1-1000 | samtools fastq -1 read_1.fq -2 read_2.fq -

#[M::bam2fq_mainloop] discarded 0 singletons

#[M::bam2fq_mainloop] processed 8702 reads

看起来似乎我们成功了，那让我们把这些序列比对回去吧

bwa mem refs/AF086833.fa read_1.fq read_2.fq

[mem_sam_pe] paired reads have different names: "SRR1553500.11772", "SRR1553500.43775"

你会发现这里产生了错误。这个错误说的是配对的read名字不同。导致问题的原因是：samtools fastq会按照fastq在bam里原本的顺序进行提取，而按照位置排序的bam的两个配对read并不是前后紧挨着的。所以我们需要进行一波排序。

cat read_1.fq \

| paste - - - - \

| sort -k1,1 -S 3G \

| tr '\t' '\n' \

| gzip > read_1.fq.gz

cat read_2.fq \

| paste - - - - \

| sort -k1,1 -S 3G \

| tr '\t' '\n' \

| gzip > read_2.fq.gz

这里将5个shell命令用管道连起来完成这个任务，咋看起来比较复杂，但是理解每一步的目的，每个参数的作用，以后就能活用起来了。

首先用cat逐行读取read，传入到paste中。paste的作用是将多个文件合并成一个文件，做法比较简单粗暴，举个例子

cat A.txt

A

B

C

cat B.txt

D

E

F

paste A.txt B.txt

A D

B E

C F

cat read_1.fq | paste - - - -表示读取4行合并成一行。相当于fastq里的read都会用一行而不是四行表示。接着用sort按照第一行(-k1,1)排序，内存的缓冲数据为3G(-S 3G). 然后将制表符替换成换行符，让一行又变回到4行，后续是压缩成gz，降低磁盘占用。

这样做其实还没又解决问题，因为这两个文件里的reads数其实不相同，我们需要进一步从里面剔除掉只有一方才有的read。这里使用的seqkit，一个非常强大的序列处理轮子。

seqkit grep -f read_flt_2.fq

seqkit grep -f read_flt_1.fq

wc -l read_flt_1.fq

15028 read_flt_1.fq

wc -l read_flt_2.fq

15028 read_flt_2.fq

终于，你得到了配对存放的两个fastq文件。

通过这个案例我想表达的观点是：虽然有些时候没有现成的工具可以解决你的问题，但是你可以通过组合几个现有的工具来完成。也就是将一个大问题拆解成几个独立的小问题，然后逐个击破。

当然，你首先得熟悉一些已有的工具，比如说常用unix命令:sort, paste, tr等，和一些非常强大生信命令行工具：samtools, bedtools, seqkit等。

一个更佳方便的方法

前面只是问题的一种方法，可能还不是最好的，但是我当初最先想到的一个比较粗暴的方法。当然更佳巧妙的方法是，提取序列之后可以按照read name排序，然后提取

samtools view -h SRR1553500.bam KJ660346.1:1-1000 | samtools sort -n | samtools fastq -1 read_1.fq -2 read_2.fq -s singleton.fq -

是不是更好理解了。

Basic local alignment search tool (BLAST)

包括：blastn, blastp, blastx, tblastn, tblastx等. 使用conda安装即可。

conda install -c bioconda blast

# blast安装perl模块的方法

conda install perl-digest-md5

BLAST的主要理念

Search may take place in nucleotide and/or protein space or translated spaces where nucleotides are translated into proteins.

Searches may implement search “strategies”: optimizations to a certain task. Different search strategies will return different alignments.

Searches use alignments that rely on scoring matrices

Searches may be customized with many additional parameters. BLAST has many subtle functions that most users never need.

本地BLAST的基本步骤

用makeblastdb为BLAST提供数据库

选择blast工具，blastn,blastp

运行工具，有必要的还可以对输出结果进行修饰

第一步：建立检索所需数据库

BLAST数据库分为两类，核酸数据库和氨基酸数据库，可以用makeblastbd创建。可以用help参数简单看下说明。

$ makeblastdb -help

USAGE

makeblastdb [-h] [-help] [-in input_file] [-input_type type]

-dbtype molecule_type [-title database_title] [-parse_seqids]

[-hash_index] [-mask_data mask_data_files] [-mask_id mask_algo_ids]

[-mask_desc mask_algo_descriptions] [-gi_mask]

[-gi_mask_name gi_based_mask_names] [-out database_name]

[-max_file_sz number_of_bytes] [-logfile File_Name] [-taxid TaxID]

[-taxid_map TaxIDMapFile] [-version]

-dbtype

具体以拟南芥基因组作为案例，介绍使用方法：

注： 拟南芥的基因组可以在TAIR上下在，也可在ensemblgenomes下载。后者还可以下载其他植物的基因组

# 下载基因组

wget ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-36/fasta/arabidopsis_thaliana/dna/Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa.gz

gzip -d Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa.gz

# 构建核酸BLAST数据库

makeblastdb -in Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa -dbtype nucl -out TAIR10 -parse_seqids

# 下载拟南芥protein数据

wget ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-36/fasta/arabidopsis_thaliana/pep/Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa.gz

# 构建蛋白BLAST数据库

gzip -dArabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa.gz

makeblastdb -in Arabidopsis_thaliana.TAIR10.pep.all.fa -dbtype prot -out TAIR10 -parse_seqids

如果你从NCBI或者其他渠道下载了格式化过的数据库，那么可以用blastdbcmd去检索blast数据库，参数很多，常用就如下几个

db string : string表示数据库所在路径

dbtype string,: string在(guess, nucl, prot)中选择一个

检索相关参数

-entry all 或 555, AC147927 或 gnl|dbname|tag'

-entry_batch 提供一个包含多个检索关键字的文件

-info 数据库基本信息

输出格式 -outfmt %f %s %a %g ...默认是%f

out 输出文件

show_blastdb_search_path: blast检索数据库路径

使用案例

# 查看信息

blastdbcmd -db TAIR10 -dbtype nucl -info

# 所有数据

blastdbcmd -db TAIR10 -dbtype nucl -entry all | head

# 具体关键字，如GI号

blastdbcmd -db TAIR10 -dbtype nucl -entry 3 | head

还有其他有意思的参数，可以看帮助文件了解

可选：BLAST安装和更新nr和nt库

安装nt/nr库需要先进行环境变量配置，在家目录下新建一个.ncbirc配置文件，然后添加如下内容

; 开始配置BLAST

[BLAST]

; 声明BLAST数据库安装位置

BLASTDB=/home/xzg/Database/blast

; Specifies the data sources to use for automatic resolution

; for sequence identifiers

DATA_LOADERS=blastdb

; 蛋白序列数据库存本地位置

BLASTDB_PROT_DATA_LOADER=/home/xzg/Database/blast/nr

; 核酸数据库本地存放位置

BLASTDB_NUCL_DATA_LOADER=/home/xzg/Database/blast/nt

[WINDOW_MASKER]

WINDOW_MASKER_PATH=/home/xzg/Database/blast/windowmasker

配置好之后，使用BLAST+自带的update_blastdb.pl脚本下载nr和nt等库文件(不建议下载序列文件，一是因为后者文件更大，二是因为可以从库文件中提取序列blastdbcmd -db nr -dbtype prot -entry all -outfmt "%f" -out nr.fa ，最主要是建库需要花费很长时间)，直接运行下列命令即可自动下载。

nohup time update_blastdb.pl nt nr > log &

如果你不像通过update_blastdb.pl下载nr和nt等库文件，也可以是从ncbi上直接下载一系列nt/nr.xx.tar.gz文件，然后解压缩即可，后续还可以用update_blastdb.pl进行数据更新。

报错： 使用update_blastdb.pl更新和下载数据库时候出现模块未安装的问题。解决方法，首先用conda安装对应的模块，然后修改update_blastdb.pl的第一行，即shebang部分，以conda的perl替换，或者按照如下方法执行。

perl `which update_blastdb.pl`

下载过程中请确保网络状态良好，否则会出现Downloading nt.00.tar.gz...Unable to close datastream报错。

第二步：选择blast工具

根据不同的需求，比如说你用的序列是氨基酸还是核苷酸，你要查找的数据是核甘酸还是氨基酸，选择合适的blast工具。不同需求的对应关系可以见下图(来自biostars handbook)

BLAST工具

不同工具的应用范围虽然不同，但是基本参数都是一致的，学会blastn，基本上其他诸如blastp,blastx也都会了。

blastn的使用参数很多 blastn [-h] ，但是比较常用是如下几个

-db : 数据库在本地的位置，或者是NCBI上数据库的类型,如 -db nr

BLAST库

-query: 检索文件

-query_loc : 指定检索的位置

-strand： 搜索正义链还是反义链，还是都要

out : 输出文件

-remote： 可以用NCBI的远程数据库， 一般与 -db nr

-evalue 科学计数法，比如说1e3，定义期望值阈值。E值表明在随机的情况下，其它序列与目标序列相似度要大于这条显示的序列的可能性。 与S值有关，S值表示两序列的同源性，分值越高表明它们之间相似的程度越大

E值总结： 1.E值适合于有一定长度，而且复杂度不能太低的序列。2. 当E值小于10-5时，表明两序列有较高的同源性，而不是因为计算错误。3. 当E值小于10-6时，表时两序列的同源性非常高，几乎没有必要再做确认。

与联配计分相关参数： -gapopen，打开gap的代价；-gapextend， gap延伸的代价；-penalty：核酸错配的惩罚； -reward， 核酸正确匹配的奖励；

结果过滤：-perc_identity, 根据相似度

注 BLAST还提供一个task参数，感觉很有用的样子，好像会针对任务进行优化速度。

第三步：运行blast，调整输出格式。

我随机找了一段序列进行检索

echo '>test' > query.fa

echo TGAAAGCAAGAAGAGCGTTTGGTGGTTTCTTAACAAATCATTGCAACTCCACAAGGCGCCTGTAATAGACAGCTTGTGCATGGAACTTGGTCCACAGTGCCCTACCACTGATGATGTTGATATCGGAAAGTGGGTTGCAAAAGCTGTTGATTGTTTGGTGATGACGCTAACAATCAAGCTCCTCTGGT >> query.fa

用的是blastn 检索核酸数据库。最简单的用法就是提供数据库所在位置和需要检索的序列文件

blastn -db BLAST/TAIR10 -query query.fa

# 还可以指定检索序列的位置

blastn -db BLAST/TAIR10 -query query.fa -query_loc 20-100

# 或者使用远程数据库

blastn -db nr -remote -query query.fa

blastn -db nt -remote -query query.fa

以上是默认输出，blast的-outfmt选项提供个性化的选择。一共有18个选择，默认是0。

0 = Pairwise,

1 = Query-anchored showing identities,

2 = Query-anchored no identities,

3 = Flat query-anchored showing identities,

4 = Flat query-anchored no identities,

5 = BLAST XML,

6 = Tabular,

7 = Tabular with comment lines,

8 = Seqalign (Text ASN.1),

9 = Seqalign (Binary ASN.1),

10 = Comma-separated values,

11 = BLAST archive (ASN.1),

12 = Seqalign (JSON),

13 = Multiple-file BLAST JSON,

14 = Multiple-file BLAST XML2,

15 = Single-file BLAST JSON,

16 = Single-file BLAST XML2,

17 = Sequence Alignment/Map (SAM),

18 = Organism Report

其中6，7，10，17可以自定输出格式。默认是

qaccver saccver pident length mismatch gapopen qstart qend sstart send evalue bitscore

简写

含义

qaccver

查询的AC版本(与此类似的还有qseqid,qgi,qacc,与序列命名有关)

saccver

目标的AC版本(于此类似的还有sseqid,sallseqid,sgi,sacc,sallacc,也是序列命名相关)

pident

完全匹配百分比 (响应的nident则是匹配数)

length

联配长度(另外slen表示查询序列总长度，qlen表示目标序列总长度)

mismatch

错配数目

gapopen

gap的数目

qstart

查询序列起始

qstart

查询序列结束

sstart

目标序列起始

send

目标序列结束

evalue

期望值

bitscore

Bit得分

score

原始得分

AC：

accession

以格式7为实例进行输出，并且对在线数据库进行检索

blastn -task blastn -remote -db nr -query query.fa -outfmt 7 -out query.txt

head -n 15 query.txt

BLAST BEST HIT

如果想输入序列，增加对应的格式qseq, sseq

blastn -query query.fa -db nr -outfmt ' 6 qseqid sseqid pident length mismatch gapopen qstart qend sstart send qseq sseq evalue bitscore'

对已有序列进行注释时常见的best hit only模式命令行

blastn -query gene.fa -out gene.blast.txt -task megablast -db nt -num_threads 12 -evalue 1e-10 -best_hit_score_edge 0.05 -best_hit_overhang 0.25 -outfmt "7 std stitle" -perc_identity 50 -max_target_seqs 1

# 参数详解

-task megablast : 任务执行模式，可选有'blastn' 'blastn-short' 'dc-megablast' 'megablast' 'rmblastn'

-best_hit_score_edge 0.05 : Best Hit 算法的边界值，取值范围为0到0.5，系统推荐0.1

-best_hit_overhang 0.25 : Best Hit 算法的阈值，取值范围为0到0.5，系统推荐0.1

-perc_identity 50 : 相似度大于50

-max_target_seqs 1 : 最多保留多少个联配

仅仅看参数依旧无用，还需要知道BLAST的Best-Hits的过滤算法。假设一个序列存在两个match结果,A和B，无论A还是B，他们的HSP(High-scoring Segment Pair, 没有gap时的最高联配得分)一定要高于best_hit_overhang，否则被过滤。如果满足下列条件则保留A

evalue(A) >= evalue (B)

score(A)/length(A) < (1.0-score_edge)*score(B)/length(B)

搭建网页BLAST

曾经的BLAST安装后提供wwwblast用于构建本地的BLAST网页工具，但是BLAST+没有提供这个工具，好在BLAST足够出名，也就有人给它开发网页版工具。如viroBLAST和Sequenceserver, 目前来看似乎后者更受人欢迎。

有root安装起来非常的容易

sudo apt install ruby ncbi-blast+ ruby-dev rubygems-integration npm

sudo gem install sequenceserver

数据库准备,前面步骤已经下载了拟南芥基因组的FASTA格式数据

sequenceserver -d /到/之前/建立/BLAST/文件路径

然后就可以打开浏览器输入IP:端口号使用了。

Sequenceserver高级用法

开机启动：

新建一个/etc/systemd/system/sequenceserver.service文件，添加如下内容。注意修改ExecStart.

[Unit]

Description=SequenceServer server daemon

Documentation="file://sequenceserver --help" "http://sequenceserver.com/doc"

After=network.target

[Service]

Type=simple

User=seqservuser

ExecStart=/path/to/bin/sequenceserver -c /path/to/sequenceserver.conf

KillMode=process

Restart=on-failure

RestartSec=42s

RestartPreventExitStatus=255

[Install]

WantedBy=multi-user.target

然后重新加载systemctl

## let systemd know about changed files

sudo systemctl daemon-reload

## enable service for automatic start on boot

systemctl enable sequenceserver.service

## start service immediately

systemctl start sequenceserver.service

nginx反向代理：我承认没有基本的nginx的知识根本搞不定这一步，所以我建议组内使用就不要折腾这个。简单的说就是在nginx的配置文件的server部分添加如下内容即可。

location /sequenceserver/ {

root /home/priyam/sequenceserver/public/dist;

proxy_pass http://localhost:4567/;

proxy_intercept_errors on;

proxy_connect_timeout 8;

proxy_read_timeout 180;

}

假如你有docker的话

# ubuntu

docker run --rm -itp 4567:4567 -v /path-to-database-dir:/db wurmlab/sequenceserver:1.0.11

# centos

docker run --privileged --rm -itp 4567:4567 -v /path-to-database-dir:/db wurmlab/sequenceserver:1.0.11

注意，你得在宿主机器上/path-to-database-dir建好blast索引，或者用docker exec -it docker容器名 /bin/bash 进入到容器里，用sequenceserver -d db &运行

术语列表

参考资料

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