前面我们通过RcisTarget包的 cisTarget()函数，一句代码就完成了我们的hypoxiaGeneSet.txt文本文件的171个基因的转录因子注释。见：基因集的转录因子富集分析

通过学习，我们知道这个RcisTarget包内置的motifAnnotations_hgnc是16万行，可以看到每个基因有多个motif。而且下载好的 hg19-tss-centered-10kb-7species.mc9nr.feather 文件，也是 24453个motifs的基因排序信息。但是我们留下来了一个悬念，如何从几万个注释结果里面挑选到最后100个富集成功的motif呢？

首先批量计算AUC值

如果是单细胞转录组数据里面，每个单细胞都是有一个geneLists，那么就是成千上万个这样的calcAUC分析，非常耗费计算资源和时间，就需要考虑并行处理，我们这里暂时不需要，所以直接 nCores=1 即可。

其中geneLists和motifRankings来自于前面的教程，见：基因集的转录因子富集分析

motifs_AUC

motifs_AUC

可以看到是 24453个motifs的AUC值都被计算了：

> motifs_AUC

AUC for 1 gene-sets and 24453 motifs.

AUC matrix preview:

jaspar__MA1023.1

geneListName 0.03819963

taipale_cyt_meth__IRX3_NACGYRNNNNNNYGCGTN_eDBD_meth

geneListName 0.05625049

taipale__DBP_DBD_NRTTACGTAAYN

geneListName 0.0640565

cisbp__M4240

geneListName 0.02816458

scertf__macisaac.ACE2

geneListName 0.03124153

>

挑选统计学显著的motif

auc

hist(auc, main="hypoxia", xlab="AUC histogram",

breaks=100, col="#ff000050", border="darkred")

nes3

abline(v=nes3, col="red")

可以看到 24453个motifs的AUC值看起来满足正态分布，一般来说，对正态分布，我们会挑选 mean+2sd范围外的认为是统计学显著，但是作者卡的比较严格，是 mean+3sd ，示意图如下：

看看Area Under the Curve (AUC)如何计算

这个时候就需要一个取舍了，我们是否需要知道每个细节，比如GSEA分析，我也多次讲解：

但实际上，绝大部分读者并没有去细看这个统计学原理，也不需要知道gsea分析的nes值如何计算，或者说这个Area Under the Curve (AUC)如何计算。

我这里也不想耗费时间去深究，去讲解了。不理解原理并不影响大家使用，知道这个概念，知道如何根据AUC值去判断结果就好。其实这个包的核心在于motifRankings变量，数据库文件来自于前面的教程，见：基因集的转录因子富集分析，也是很容易制作的，选取人类的不到2000个TF的全部chip-seq数据的peaks文件的bed，把人类的2万个基因的启动子区域的该TF的信号强度排序即可。

然后看看motif的详情

这个RcisTarget包内置的motifAnnotations_hgnc是16万行，可以看到每个基因有多个motif，我们挑选出来了105个moif，去这个表格里面筛选一下，就只剩下82个了。

data(motifAnnotations_hgnc)

motifAnnotations_hgnc

cg=auc[auc>nes3]

names(cg)

cgmotif=motifAnnotations_hgnc[match(names(cg),motifAnnotations_hgnc$motif),]

cgmotif=na.omit(cgmotif)

高级分析之可视化motif

前面的教程，一句代码就完成了motif的富集 ，见：基因集的转录因子富集分析

这个时候，我们可以根据 addLogo 函数，对我们富集好的转录因子的motif加上一些可视化图表，代码如下：

motifEnrichmentTable_wGenes

motifEnrichmentTable_wGenes_wLogo

library(DT)

datatable(motifEnrichmentTable_wGenes_wLogo[,-c("enrichedGenes", "TF_lowConf"), with=FALSE],

escape = FALSE, # To show the logo

filter="top", options=list(pageLength=5))

这些motif都是数据库已知的，其可视化如下：

高级分析之网络图

这里面的R代码技巧还是蛮值得细细品读的：

anotatedTfs

motifEnrichmentTable$geneSet),

function(x) {

genes

genesSplit

return(genesSplit)

})

anotatedTfs$hypoxia

signifMotifNames

incidenceMatrix

motifRankings,

signifRankingNames=signifMotifNames,

plotCurve=TRUE, maxRank=5000,

genesFormat="incidMatrix",

method="aprox")$incidMatrix

library(reshape2)

edges

edges

colnames(edges)

library(visNetwork)

motifs

genes

nodes

label=c(motifs, genes),

title=c(motifs, genes), # tooltip

shape=c(rep("diamond", length(motifs)), rep("elypse", length(genes))),

color=c(rep("purple", length(motifs)), rep("skyblue", length(genes))))

visNetwork(nodes, edges) %>% visOptions(highlightNearest = TRUE,

nodesIdSelection = TRUE)

一个简陋的网络图就出来了：

PPI调控网络图确实有点老套了

我有预感，这个转录因子调控网络图应该是在未来5年内会逐步替代PPI调控网络图，直到转录因子调控网络图也变得俗气为止。

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