大家在分析流式数据时，因为种种原因，难免不满足于仪器自带软件的分析功能，因此会寻求第三方数据分析软件，比如Flowjo或者Kaluza等，因此本期以贝克曼公司的CytoFLEX系列流式数据为例，演示如何使用Flowjo软件进行基本数据分析，另外该步骤也同样适用于BD的流式仪器和贝克曼公司的其他流式数据分析

注：盗版Flowjo软件会引起数据分析时的各种兼容性问题，所以请支持正版软件，当然也可以欢迎各位老师选择性价比更高的Kaluza软件(本公众号第5期开始，有连续5期关于Kaluza软件使用的视频指导以及软件下载地址)！

一 数据的导出

从新建实验时的文件存储文件夹，一次性拷贝所有的FCS文件，如下箭头

也可选择所需FCS文件，右键选择导出FCS文件，可以自行选择面积或高度信号进行导出，以及是否导出强自发荧光FCS 3.0文件

二  Flowjo软件下数据的分析步骤

2.1   打开Flowjo V10及以上版本，新建一个组，并命名，可以根据自己需要对组进行编辑标签，如下图

2.2  将所有的FCS文件拖拽入所建立的文件夹

2.3 双击其中一个FCS文件

2.4 在出现的散点图中，单击选择X轴或者Y轴选择对应的参数，比如下图的FSC和SSC，由于电压设置较低，所以需要修改坐标轴显示范围

注：为了更完美地显示数据，需要微调坐标轴动态范围以及坐标轴的显示方式，为什么需要调整呢？参见Flowjo官网下图数据说明，双指数转换后的数据明显优于Log显示下的数据，因此优化后的坐标轴显示方式以及动态范围更能真实准确的呈现我们的数据，所以市面所有的流式数据都应该谨慎对待

2.5  基于以上解释，下面进行散射光的线性显示方式调节：对X轴FSC-A依次点击下图步骤①和②

下图左，可见信号贴近左边的原点，因此点击下图红圈-号，放大坐标轴低信号区，直到主要信号群均一分布在可视范围内，如下图右。同理再次点击Y轴对SSC-A进行调节

注：如果可见信号超出右边的可视范围，如下图左，点击下图左中的红圈+号，调节坐标轴强信号区，直到信号均一分布在可视范围内，如下图右

根据以上流程，调好的散射光如下图：

2.6  画门：通过点选并激活下图矩形框内的相应画门快捷键，在散点图中完成画门，圈中目标细胞

2.7 荧光二维参数图的调节：

2.7.1 双击下图左的目的细胞群，系统自动出现下图右的二维散点图，根据需求，参照第2.4步分别选择X轴和Y轴的目的分析参数，比如分析NK细胞，下图右则选择CD3和CD56作为X轴和Y轴

2.7.2   荧光参数坐标轴的调整：分别点击下图的①和②

2.7.3 坐标轴scale的选择：根据需要选择Logarithmic、ArcSinh等显示方式，此处选择的是Biex，如下红圈处

2.7.4  下图可见阴性信号贴原点坐标轴，可通过调节下图transforms区域的Width Basis，即W，压缩坐标轴0附件的信号为线性信号，如果有弱阳性，则可以将N区域的Extra Neg调解到0.5-1，最终结果图如下图右

注：下图则为W信号调节不好与好的案例图，中间图为最佳

2.7.5 完成作图，并对自己感兴趣的细胞群进行画门，如下为CD3+CD4+以及Treg的圈门图

2.8  单参数直方图的调节：双击目的细胞群，系统弹出的双参数散点图中，在Y轴单击箭头所示矩形框，然后选择Histogram

最后直方图如下图左，并为阳性信号群画门，如需要更改门名字，可以单击选中门，并右键更改门的名字，如下图右

2.9  调好第一个数据的方案后，如下选中红圈内的画门步骤并右键选择copy，再在下图中选中剩下的所有数据，并粘贴，即可将分析方案应用到所有的数据

2.10  散点图或者直方图可以直接拷贝使用，也可以拷贝到编辑模板(Layout Editor)后期编辑，即在需要的流式图界面右键，依次选择Copy to Layout Editor

2.11  可在Layout Editor区，利用各种功能键，对图形进行统一编排，如下图

2.12  编辑好图形的导出：依次点击file和Export Image，然后选择自己需要的图形格式，比如PDF或者JPG等图形文件

三.、补偿的调节

根据笔者的经验，Flowjo调节补偿其实不是特别方便，在这方面非常优秀的其实是Kaluza软件，利用其add all plots功能可以非常直观的快速调节好补偿(参见本公众号视频介绍)，所以建议经验不多的老师，先在仪器上把补偿调好，再导入Flowjo软件进行分析，下图以Flowjo软件为例演示针对补偿不对的数据，如何进行补偿优化

3.1 软件主界面，菜单栏tools下点击Edit Compensation Matrix

3.2 点击Edit并选择YES

3.3 如下图，红圈从左至右，可以依次选择调节补偿的数据、特定的门、何种方式看散点图分布(可选N x N或其他)以及是否叠加补偿前与补偿后的数据(可不勾选)

3.4 从上图的二维散点图中可见数据并非横平竖直的正确补偿，因此在上方矩阵表中特定位置输入正确补偿值，数据图分布正常，如下图

3.5 可以选择Save Matrix，后期在软件主界面，采取拖拽的方式应用于其他所有的数据

本人水平有限，以上步骤仅供参考，如有疑问，欢迎留言共同讨论，谢谢！