本次笔记为美格基因宏基因组课程笔记

1. quality control
2. Reads-based分析
- 2.1 物种分类鉴定
- 2.2 揭示物种多样性
- 2.3 功能分类鉴定
- 2.4 数据库和比对算法的选择
- 2.5 序列的均一化原理与方法
- 2.6 数据表深入分析
- 2.7 分析示例
3. Contig拼接
- 3.1 拼接算法：de Bruijn Graph算法
- 3.2 Contig拼接算法和策略
- 3.3 Contigs-based分析
4. Binning分箱
- 4.1 MAGs：宏基因组组装基因组
- 4.2 Binning基本依据
- 4.3 Binning质量评估
- 4.4 Binning结果整合
- 4.5 Binning进一步分析
- - 单菌
  - 菌群
5. 总结
- 5.1 分析比较
- 5.2 分析局限与挑战
- 5.3 分析建议

1. quality control

质量检测
FastQC
低质量序列过滤及剔除接头
Trimmomatic
宿主机污染序列过滤
FastQ Screen；Bowtie2

2. Reads-based分析

定义：使用测序后的clean reads直接与数据库中的序列进行比对分析，通过比对获得已知物种或功能基因序列的检测丰度

2.1 物种分类鉴定

序列比对上基因组数据库不一定鉴定到物种，可能有保守序列
Marker-based检测局限性：16S数据库分辨率不高，物种分类模糊

2.2 揭示物种多样性

基于基因组、蛋白数据库的分析方法可能会高估物种的多样性，产生较多的丰度极低的物种类群，且可靠性不高；
基于16S序列比对的方法（EMIRGE、phyloFlash）产生的多样性与16S测序结果接近，丰度比例有差异，从原理上宏基因组结果更接近真实分布

2.3 功能分类鉴定

2.4 数据库和比对算法的选择

数据库的大小直接决定read-based分析结果的准确性
大的数据库运算慢，因此一般比对较小的通用数据库（KEGG/EGGnog/COG），或专业数据库(ARFs-OAP/NcycDB/CAZy)

比对数据库通常为蛋白数据库
算法选择：

Blastx
Diamond
HMMER

注：Reads-based通常需要多线程并行计算

2.5 序列的均一化原理与方法

2.6 数据表深入分析

Alpha
Beta
物种组成
差异比较
相关分析
网络分析
系统发育树
代谢通路、富集通路

2.7 分析示例

有生物学重复；挑选功能基因（与氮循环相关基因）

3. Contig拼接

3.1 拼接算法：de Bruijn Graph算法

3.2 Contig拼接算法和策略

常用工具

metaSPAdes(内存消耗较高)
SPAdes
MEGAHIT（均衡性好）
CLC
IDBA-UD

Contig拼接通常是每个样本独立进行，但生物学重复样本的clean reads在条件允许的情况下可以合并起来一起拼接。

3.3 Contigs-based分析

contigs可以与已知基因数据库的比对分析；
可以进行ORF和蛋白预测；
针对特殊基因和区段
可以通过contigs查找其上下游的调控位点或包含的区域特征

4. Binning分箱

4.1 MAGs：宏基因组组装基因组

MAGs流程

MetaWRAP：2020年新出的工具，集成度更高
MAGs定义：把一些性质相似的contigs分配到一起的过程
注：

1.得到的bin set由被分配到该bin下的多条contigs组成，但contigs依然是独立的
2.Binning后的MAG不是一个物种的基因组

4.2 Binning基本依据

    Coverage覆盖度TNFs四碱基频率GC含量Taxonomy物种分类信息Contigs分布规律

4.3 Binning质量评估

原理：根据物种系统发育谱中所含有的普遍存在的单拷贝标记基因集（SCCs）来提供Binning后MAG的污染度和完整度的评价；
完整度：MAG中基因与对应SCGs相比，基因数量是否完整，数值越大，Bin质量越好
污染度：一个MAg存在多个物种的程度，数值越小，Bin质量越好

4.4 Binning结果整合

三种方案

共组装（消耗大量计算资源）
共分箱（Bins污染度与共组装一样高）
dRep

进行组装和去重复可以阐述更多和更高质量的bins

4.5 Binning进一步分析

单菌

展示基因组基因分布
与近缘物种进行共线性分析
绘制细胞代谢模型
开展上下游基因分析

菌群

绘制特殊细胞代谢模型
多保守蛋白构建更精确的进化树
通过代谢网络分析物种关联

5. 总结

5.1 分析比较

5.2 分析局限与挑战

成本较高难以保持一致性
获取的基因组不完整，且没有明确的分类学信息
测序结果不能代表诱惑性的微生物类群
微生物本身属性会影响定量结果，宏基因组的相对定量信息也不能反应实际样本的绝对丰度

5.3 分析建议

根据科学问题使用reads-based分析或者Assembly-based分析
数据库、对比算法和拼接工具需要平衡准确性和运算速度
不断学习宏基因组分析的方法和软件，注意新方法的原理、适用范围及运行效率
学会使用数据库中的数据，与自己的数据进行整合分析

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