rsem比对_链特异性参数设不对结果全是错的

一.文库类型

转录组文库构建的时候，可以选择链特异性文库或非链特异性文库。

链特异性文库，我们清楚的知道得到的 reads 跟转录本是同向的还是反向的。

链特异性文库构建，有多种方法，最常用的就是基于 dUTP 的方法。

文库类型有两种表示方法。

第一种表示法

第二种表示法(PE)

第二种表示法(SE)

建库方法fr-unstranded

无

Standard Illumina

fr-firststrand

dUTP, NSR, NNSR

fr-secondstrand

Ligation, Standard SOLiD

第一种表示方法：

第二种表示方法：

二.参数设置

在数据分析中，最复杂、最容易出错、出错了影响最为严重的除了用错书记，就是搞错文库类型参数了。设置错了可能导致转录本很短、表达量极低、比对率极低等。在数据分析的时候，一定要问清楚构建文库的实验人员。

常用软件的参数设置如下。

1. 转录本拼接软件

在进行转录本拼接的时候，需要考虑链特异性的问题。

1.1 Trinity

非链特异性默认，不需要设置

链特异性参数为：—SS_lib_type ，如果使用dUTP，值为 RF

1.2 cufflinks

非链特异性 —library-type fr-unstranded, 默认

链特异性如果使用dUTP：—library-type fr-firststrand

2. 将 reads 比对到基因组的软件

2.1 tophat

非链特异性 —library-type fr-unstranded, 默认

链特异性如果使用dUTP：—library-type fr-firststrand

2.2 hisat2

非链特异性默认，不需要设置

链特异性如果使用dUTP: —rna-strandness RF，添加了该参数后，每条 reads 将在 sam 文件中出现 XS 的tag，‘+’ ‘-’ 代表该 reads 所在的转录本与基因组序列的关系。

2.3 STAR

STAR 的比对中，不需要手动设置文库类型的参数。

3.表达定量

表达定量软件根据比对的 sam 文件，计算 read counts，需要提供链特异性信息。

3.1 eXpress

非连特异性默认，不需要设置

链特异性如果使用dUTP：—rf-stranded

3.2 RSEM

RSEM 使用 --strandedness 参数设置。

非链特异性 --strandedness none

链特异性如果使用dUTP: --strandedness reverse

本文来自基因课，生物信息视频课程，每周更新。

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