「Hortic Res」CaCIPK3基因正向调控辣椒的耐旱性

2024-05-23 22:56:36

文章信息

题目：The CaCIPK3 gene positively regulates drought tolerance in pepper

刊名：Horticulture Research

作者：Zhen-Hui Gong et al.

单位：Northwest A&F University

Published: 01 October 2021

摘要

1

干旱胁迫是限制植物生长、发育和生产力的主要农业问题。钙调神经磷酸酶 B 类蛋白 (CBLs) 和 CBL 相互作用蛋白激酶 (CIPKs) 显着影响植物对不同胁迫的反应。然而，CBL-CIPK在辣椒干旱胁迫响应中的分子机制尚不清楚。在此，探讨了CaCIPK3在辣椒 (Capsicum annuum L.) 干旱胁迫调控中的作用。转录组数据和实时定量PCR (qRT-PCR) 分析表明CaCIPK3参与了对多种压力的反应。敲低辣椒中的CaCIPK3增加了对甘露醇和茉莉酸甲酯 (MeJA) 的敏感性。CaCIPK3的瞬时过表达通过增强抗氧化系统的活性和正向调节茉莉酸 (JA) 相关基因来提高耐旱性。CaCIPK3在番茄中的异位表达也改善了干旱和 MeJA 抗性。作为 CaCIPK3 相互作用的伙伴，CaCBL2 正向影响抗旱性。此外，CaWRKY1 和 CaWRKY41 直接结合CaCIPK3启动子以影响其表达。本研究表明，CaCIPK3通过 CBL-CIPK 网络作为抗干旱胁迫的正调节因子来调节 MeJA 信号传导和抗氧化防御系统。

技术路线

2

主要结果

3

3.1 CaCIPK3的序列、亚细胞定位和进化分析

CaCIPK3编码的蛋白质有440个氨基酸残基，分子量为49.81 kDa。CaCIPK3属于包含零内含子的内含子贫乏进化枝。MSA分析表明CaCIPK3具有CIPK家族的典型结构。NAF 基序位于蛋白激酶结构域和 PPI 基序之间。此外，CaCIPK3 含有跨膜螺旋，表明它可能位于膜上（补充图 S1A）。CaCIPK3的位置和潜在功能研究表明，该基因在CaMV35S启动子和GFP之间融合（补充图S 1B）。载体 (pvbg2307:CaCIPK3-GFP) 在普通烟草中瞬时表达。在整个细胞中观察到对照（pvbg2307：GFP）的表达，而CaCIPK3-GFP蛋白仅在质膜中可见。进行系统发育分析以分析CIPK在许多物种中的进化关系。根据结果，CaCIPK3 与番茄 SlCIPK14 和烟草 NtCIPK14 最相似（补充图 S1C）。

3.2 CaCIPK3在辣椒和拟南芥中的表达分析

将CaCIPK3在各种压力和激素下的表达模式与已发表的 RNA-seq 数据相结合，以探索其潜在功能。CaCIPK3对多种胁迫有反应，包括甘露醇、NaCl、ABA、JA、冷和热。进行定量 RT-PCR 以进一步验证在不同时间点在 NaCl、甘露醇、MeJA 和 ABA 处理下CaCIPK3表达的转录组数据（图1A-D）。CaCIPK3NaCl和MeJA处理后表达略有增加，处理后6 h表达最高。ABA 应用在 6 小时前降低了 CaCIPK3的表达，但在 12 小时增强了其表达。在甘露醇处理下，CaCIPK3表达在 6 小时时间点达到峰值。总之，这些结果表明甘露醇、MeJA 和 ABA 诱导CaCIPK3表达。考虑到CaCIPK3 是Ca2+信号通路的成员，所以评估了Ca 2+是否影响CaCIPK3表达。在不同浓度的 CaCl2下，在 6 小时的时间点检测CaCIPK3的表达。CaCIPK3表达由较低的CaCl 2浓度诱导并由较高的浓度（> 50 mM）诱导下调（图1E），这意味着CaCIPK3可能在Ca2+信号通路中至关重要。

在辣椒的不同组织中评估CaCIPK3转录水平以了解其空间表达。CaCIPK3转录水平在根和叶中最高（图1F）。空间表达也受到启动子的影响。选择总共 1500 bp 的CaCIPK3启动子来分析顺式作用元件。我们发现了四个 MeJA 相关的顺式作用元件，推测CaCIPK3可能参与 MeJA 信号传导。值得注意的是，在启动子中鉴定了一个可能被 WRKY 蛋白识别的 W-box (TTGACC) 元件，表明 WRKY 蛋白可能调节CaCIPK3。用 pCAMBIA- CaCIPK3 pro :GUS载体转化拟南芥，以检测CaCIPK3启动子是否影响不同组织中的 GUS 表达。CaCIPK3 pro在叶、花和根中的 GUS 活性高于成熟植物的种子和茎（图1G a-e）。在两周大的拟南芥幼苗中，CaCIPK3在所有器官中均有表达，尤其是在子叶中。值得注意的是，幼苗鲜叶中的 GUS 活性是由甘露醇和 MeJA 诱导的，而不是由盐或 ABA 诱导的（图1G f-k）。

3.3 CaCIPK3的沉默降低辣椒对干旱和MeJA的抗性

过量的甘露醇和 MeJA 激活了 CaCIPK3 的表达，这意味着CaCIPK3可能参与干旱和 MeJA 应激反应。进行 VIGS 测定以检查甘露醇诱导的脱水应激38和 MeJA 处理下辣椒中CaCIPK3沉默的影响。选择了一个特定的 309 bp 的CaCIPK3片段来沉默辣椒中的CaCIPK3。注射 4 周后，CaCIPK3表达显着下降，证实CaCIPK3在叶片中成功沉默（图2A）。经过四天的水培培养后，将植物浸入 300 mM 甘露醇中以模拟干旱胁迫。与对照植物相比，CaCIPK3沉默的叶子在处理后 6 小时显着枯萎（图2B）。CaCIPK3沉默植物的叶片积累了更多的MDA，这反映了膜损伤的程度（图2C）。使用 DAB 染色测定对照植物和CaCIPK3沉默植物中的H2O2积累，并通过检测试剂盒进一步定量。CaCIPK3沉默的植物比对照植物表现出更多的 H2O2积累（图2D-E）。此外，还测量了POD、SOD 和 CAT。这些酶在甘露醇胁迫下的对照植物中显着增加（图2F-H）。在对照和CaCIPK3沉默的植物中，在甘露醇胁迫 6 小时后检查气孔形态。在正常条件下，在对照和CaCIPK3沉默的植物之间没有观察到气孔孔径（宽长比）的显着差异（图2I，J）。还检测了对照与CaCIPK3沉默植物中抗氧化相关基因（CaSOD、CaPOD和CaCAT ）的表达。这些基因在对照植物的叶子中的表达水平高于在CaCIPK3沉默植物的叶子中的表达水平（图2F）。在甘露醇处理下， CaCIPK3沉默植物和对照植物的叶子中都迅速诱导了脱水相关基因（CaRD22和CaRD29B ）。这些基因的表达在对照植物的叶子中更高（图2F）。JA生物合成和信号通路基因的表达（CaAOC、CaMYC和CaJAZ ) 在CaCIPK3沉默的植物和对照植物中发生了改变。与CaCIPK3沉默植物的叶片相比，对照叶片中CaAOC和CaMYC的表达较高，而CaJAZ的转录水平较低（图2F）。

3.4 CaCIPK3的瞬时过表达增强辣椒对干旱和MeJA的耐受性

35S:CaCIPK3-GFP 载体在辣椒叶中过表达，以研究CaCIPK3对干旱和 MeJA 的响应效果。35S:GFP 空载体作为对照。使用 qRT-PCR 分析CaCIPK3的表达水平，并在接种后两天通过 Open FluorCam FC 800 观察 GFP 信号（图3A）。植物在室温下在干燥的土壤中生长。与瞬时过表达CaCIPK3-GFP的叶片相比，对照叶片在 8 h 时明显枯萎（图3B）。瞬时过表达CaCIPK3的叶片具有较低的 MDA 和 H2O2与对照叶片相比，主要活性氧清除酶的含量但活性增强（图3C-H）。此外，CaCIPK3的瞬时过表达减少了响应干旱胁迫的气孔开放（图3I，J）。我们检测了抗氧化相关基因、应激相关基因和JA相关基因的表达。在正常条件下瞬时过表达CaCIPK3的叶片中， CaRD22和CaAOC的转录水平增加，而CaJAZ的转录水平降低（图3M）。

还在瞬时过表达CaCIPK3的叶子中检查了CaCIPK3响应 MeJA的功能。对照叶片的叶盘由于叶绿素降解而呈现变黄，而那些瞬时过表达CaCIPK3的叶片在 MeJA 处理后仍保持绿色。总的来说，这些结果表明CaCIPK3敲低降低了辣椒对干旱和 MeJA 的抗性。相反，CaCIPK3过表达提高了辣椒对这些胁迫的耐受性，表明CaCIPK3影响辣椒对干旱和 MeJA 的抗性相关。

3.5 CaCIPK3改善转基因番茄的干旱和 MeJA 耐受性

为了进一步阐明CaCIPK3在耐旱性中的作用，CaCIPK3在番茄植株中异源表达。将纯合系（过表达CaCIPK3的 OE-2、OE-6 和 OE-9 ）和 WT 系的发芽种子播种在补充有 0.15 M 甘露醇或 0.1 mM MeJA 的 MS 培养基上并培养 7 天（图4A）。与 WT 植物相比，暴露于甘露醇的CaCIPK3转基因幼苗的根长度显着增加（图4B）。在 MeJA 处理下，幼苗的根部生长缓慢，特别是在 WT 植物中（图4C）。此外，从 4 周龄的 WT 和 OE 植物中停止浇水 7 天以诱导干旱胁迫，而对照组则正常浇水。7天后，WT植物的大部分叶子明显枯萎，而转基因植物的叶子表现出轻微的卷曲。在干旱胁迫期间，WT 植物在 6 天和 7 天的时间点表现出比 OE 植物更高的失水率（图4D）。此外，WT 叶片中的 H2O2和MDA 水平显着高于 OE 叶片（图4E-G）。尽管 POD、SOD 和 CAT 的含量在所有处理组中都增加了，但在转基因植物中它们显着更高（图4H-J )。此外，与WT植物相比，转基因植物的叶气孔孔径减少（图4K，L）。干旱胁迫后，与胁迫、抗氧化剂和 JA 相关的基因在 WT 和 OE 植物中差异表达（图4M）。表达模式与在辣椒中观察到的一致。

3.6 敲低 CaCBL2会降低辣椒的抗旱性

使用 VIGS 测定选择特定的 272 bp 序列CaCBL2以成功沉默CaCBL2（补充图 S4A）。与对照植物相比，CaCBL2沉默的植物对甘露醇胁迫更敏感（补充图 S4B）。CaCBL2沉默的植物中MDA 和H2O2的含量迅速增加（补充图S 4C-E）。同时，对照植物中的 POD、SOD 和 CAT 活性较高（补充图 S4F-H )。此外，检查了CaCBL2沉默的植物和对照植物中的气孔形态。与CaCBL2沉默的植物相比，对照植物的气孔孔径减少（补充图 S4I-J）。此外，对照植物中与抗氧化、应激和 JA 信号传导相关的基因的转录水平显着高于CaCBL2沉默的植物（补充图S4K）。这些发现表明，CaCBL2通过与 CaCIPK3 相互作用削弱了辣椒对干旱的抗性。

3.7 CaCIPK3启动子由 CaWRKY1 和 CaWRKY41 蛋白调节

研究者推测 WRKYs 介导了CaCIPK3启动子的激活。选择了三种广泛研究的 CaWRKY（CaWRKY1、-41、-58）来测试它们在调节CaCIPK3启动子中的作用。Y1H 测定用于检测 CaWRKYs 是否直接靶向CaCIPK3启动子。与 AD-CaWRKYs 和 pAbAi-CaCIPK3 共转化的 Y1H Gold 酵母菌株在含有 500 ng/mL AbA 的培养基上比空对照生长得更好（图6A）。这些结果表明三个 CaWRKY 与 CaCIPK3 相关联。为了进一步检查 CaWRKYs 的功能，对烟叶中的 GUS 转录物和酶活性进行了分析。报告基因 pCaCIPK3 -Wbox-GUS 与不同的效应子（35S：CaWRKYs）结合（图6B）。结果表明CaWRKY1抑制CaCIPK3的转录活性，而CaWRKY41诱导CaCIPK3活性（图6C，D）。值得注意的是，CaWRKY58 对 CaCIPK3 活性没有显着影响。总的来说，这些结果表明 CaWRKY1 和 CaWRKY41 直接与CaCIPK3启动子结合以调节其活性。

总结

4

在干旱胁迫下，Ca2+被迅速诱导并激活 CaCBL2 以募集 CaCIPK3。CaWRKYs 直接与CaCIPK3启动子中的 W-box 结合以调节其表达。CaCIPK3的过表达增强抗氧化酶活性，调节JA相关基因的表达，促进气孔关闭，有助于提高耐旱性。实线箭头表示控制和调节的方向，而虚线箭头表示可能的机制

总之，这些发现表明CaCIPK3过表达通过调节抗氧化系统和 JA 相关基因的表达来提高耐旱性。值得注意的是，CaCIPK3 调节的MeJA 信号传导可能有助于耐旱性。这些结果提供了生理学和分子学证据来证明CaCIPK3在植物耐旱性中的重要性。

获取原文

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原文链接：https://www.nature.com/articles/s41438-021-00651-7#Sec2

补充材料：https://www.nature.com/articles/s41438-021-00651-7#Sec25

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