【Physiol Plant】转录因子PpybZIP43通过激活PpySPS3表达和与PpySTOP1互作从而促进梨果实蔗糖合成

文章信息

标题：PpybZIP43 contributes to sucrose synthesis in pear fruits by activating PpySPS3 expression and interacts with PpySTOP1

刊名：Physiol Plant

作者：Huping Zhang et al.

单位：Nanjing Agricultural University

日期：2022 Jun 11‍

摘要

蔗糖是影响梨果实甜味和风味的重要因素，但调控蔗糖合成的分子机制尚未深入研究。本文中，研究者从梨（Pyrus pyrifolia Nakai cv. 'Hosui'）果实中鉴定了一个转录因子基因 PpybZIP43，并发现 PpybZIP43 在梨果实中的瞬时过表达显着增加了蔗糖含量和蔗糖磷酸合酶基因（PpySPS3 和 PpySPS8）的相对表达水平。烟草中的亚细胞定位分析表明，PpybZIP43 定位于细胞核中。酵母单杂交、电泳迁移率变动分析 (EMSA) 和双荧光素酶报告实验表明，PpybZIP43 能够通过与启动子中的 G-box (CACGTG) 元件特异性结合来激活 PpySPS3 的表达。使用酵母双杂交、双分子荧光互补 (BiFC)、荧光素酶互补成像 (LCI) 和谷胱甘肽S-转移酶 (GST) pull down的蛋白相互作用测定表明 PpybZIP43 可以直接与 PpySTOP1 相互作用形成转录复合体。该研究有助于了解梨果实中蔗糖合成和积累的分子基础，并为育种提供候选基因。

技术路线

主要结果

3.1 蔗糖含量随着 PpybZIP43 的表达而增加

为了测试候选基因PpybZIP43与蔗糖合成之间的关系，使用qRT-PCR监测果实发育过程中的蔗糖积累过程中PpybZIP43的相对表达水平。如图1A所示，'Hosui'梨果实发育早期蔗糖含量保持在很低的状态，但从90 DAB开始显着增加，成熟时达到最大值。同样，PpybZIP43 表达在果实发育的早期阶段很低，从 90 DAB 到成熟时急剧增加（图 1A）。线性回归分析表明，PpybZIP43的相对表达量与蔗糖含量呈显着正相关（图1B）。

3.2 PpybZIP43 编码核定位的转录因子

为了鉴定PpybZIP43，我们从'Hosui'梨果实（GenBank登录号MZ501606）中分离出PpybZIP43的CDS，它长522个核苷酸，编码173个氨基酸的蛋白质。氨基酸序列分析表明，PpybZIP43 含有植物 G box结合因子 1 (GBF1) 的基本亮氨酸拉链 (bZIP) 结构域（图 2A）。系统发育分析表明，PpybZIP43与植物bZIP43转录因子密切相关，与PbrbZIP43同源性最高（图2B）。亚细胞定位结果表明，来自 35S:PpybZIP43-GFP 融合蛋白的绿色荧光信号仅存在于细胞核，而来自载体对照 (35S:GFP) 的荧光信号普遍分布在整个烟草叶肉细胞中 (图 2C)

3.3 PpybZIP43的瞬时过表达增加了蔗糖含量和PpySPS3/8的表达

为了验证 PpybZIP43 是否影响蔗糖积累，在梨果实中进行了 PpybZIP43 的农杆菌介导的瞬时过表达。与用空载体的对照水果相比，PpybZIP43 瞬时过表达水果 (PpybZIP43-OE) 中 PpybZIP43 (图 3A) 和蔗糖含量 (图 3B) 的相对表达水平显着增加。同时，我们发现 PpySPS3 和 PpySPS8 的相对表达水平在 PpybZIP43-OE 中显着上调（图 3C）。这些观察结果表明，PpybZIP43 可能通过激活 SPS 基因的表达作为蔗糖合成的正调节因子。

从“Hosui”梨果实中克隆了 PpySPS3 和 PpySPS8 的 CDS，并在'Hosui' 梨果实中进行瞬时过表达和基因沉默。我们发现 PpySPS3/8 瞬时过表达水果 (PpySPS3/8-OE) 中 PpySPS3 (图 4A)、PpySPS8 (图 4B) 和蔗糖含量 (图 4C) 的相对表达水平显着高于对照水果。相反，PpySPS3/8 瞬时沉默果实 (PpySPS3/8-TRV) 中 PpySPS3（图 4D）、PpySPS8（图 4E）和蔗糖含量（图 4F）的相对表达水平显着低于对照果实。

Fig. 3

Fig. 4

3.4 PpybZIP43与PpySPS3启动子结合并激活其表达

为了确定 PpySPS3/8 是否是 PpybZIP43 的直接靶标，选择 PpySPS3 进行酵母单杂交试验。如图 5A 所示，所有酵母转化体在缺乏亮氨酸 (SD/-Leu) 的合成确定培养基上生长良好。但添加 500 ng mL-1 Aureobasidin A 后，只有阳性对照（p53 + p53 启动子）和那些含有 PpybZIP43 + PpySPS3 启动子的转化体正常生长（图 5A）。这些结果表明，PpybZIP43 可以与 PpySPS3 的启动子相互作用。此外，电泳迁移率分析 (EMSA) 用于确认 PpybZIP43 与 PpySPS3 启动子结合的特异性（图 5B）。当合成含有 CACGTG 的寡核苷酸并将其标记为探针时，检测到特定的蛋白质-DNA 复合物，并且这些复合物的形成随着探针浓度的增加而减少（图 5B）。同时，当顺式作用元件从 CACGTG 突变为 AAAAAA 时，这些复合物的形成被消除（图 5B）。这种竞争的特异性证实了 PpybZIP43 识别并特异性结合 PpySPS3 启动子内的 CACGTG 基序。双荧光素酶报告基因测定的结果表明，与对照相比，在存在感应器和报告基因结构的情况下，LUC 活性是对照的两倍（图 5C），表明 PpybZIP43 是 PpySPS3 的转录激活剂。

3.5 PpybZIP43 与 PpySTOP1 互作

之前的研究结果表明，Cys2/His2 型锌指蛋白基因的转录与梨果实中的蔗糖合成相关。梨果实中 PpySTOP1 的瞬时过表达显着增加了蔗糖含量，但 PpySPS3/8 的相对表达水平没有发现显着差异。蛋白质相互作用分析表明 PpySTOP1 与 PpybZIP43 相互作用。

采用酵母双杂交试验来分析这两种蛋白质之间的推定相互作用。所有酵母转化体都可以在缺乏亮氨酸和色氨酸 (SD/-Leu/-Trp) 的 SD 培养基上正常生长（图 6A）。然而，在缺乏亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤 (SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade) 的 SD 选择培养基上，只有含有诱饵和猎物的酵母转化体 (PpybZIP43-BK + PpySTOP1-AD) 和阳性对照 (pGBKT7-53 + pGADT7-T) 在添加 X-α-Gal 后能够良好生长并产生蓝色斑块 (图 6A)。此外，使用双分子荧光互补 (BiFC) 和萤火虫荧光素酶互补成像 (LCI) 测定验证了 PpybZIP43 和 PpySTOP1 之间的相互作用。GST pull down以验证 PpySTOP1 和 PpybZIP43 是否可以直接相互结合。我们发现重组 His-PpySTOP1 融合蛋白可以用 GST-PpybZIP43 纯化，但不能单独用 GST 纯化（图 6D），证明了蛋白间的直接相互作用。

总结

这项工作表明 PpybZIP43 在控制梨果实中的蔗糖合成中起重要作用。基于这些结果，作者提出了一个模型，该模型与“Hosui”梨果实发育和成熟过程中蔗糖积累的分子机制一致（图 7）。该工作描述了多年生木本植物肉质果实中蔗糖合成调控的机制，为提高我们对梨和其他植物糖代谢过程中转录复合物作用的理解提供了基础，并为育种提供候选基因。

原文获取

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/ppl.13732

pdf文件获取：

https://www.scientsgene.com/h-nd-74.html#_np=107_355

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