转录因子和组蛋白修饰研究思路

表观遗传学中DNA和蛋白的互作是基因转录调控的关键，亦是基因转录启动的前提，不少科研项目都以其为切入点。DNA和蛋白互作技术有很多，比如染色质免疫共沉淀技术（ChIP）、CUT&Tag、DNA亲和纯化测序（DAP-seq）、凝胶迁移阻滞(EMSA)、酵母杂交系统和荧光素酶报告基因等。

ChIP-seq、CUT&Tag和DAP-seq“三剑客”是与高通量测序结合的技术，可在全基因组范围内研究DNA与蛋白互作，是很多课题的首选。今天，我们和大家聊聊这三种技术的差异，以及DNA蛋白互作组学的研究思路。

一、技术简介

很多小伙伴对于ChIP-seq、CUT&Tag和DAP-seq如何选择比较纠结？结合技术特点，我们谈谈它们的差异点以及如何选择。

ChIP-seq历史最悠久，技术比较成熟稳定。它首先利用染色质免疫共沉淀技术特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集到的DNA片段进行高通量测序。最后，利用生信分析在全基因组范围内获取与转录因子、组蛋白等互作的DNA区段信息。

ChIP-seq实验流程

CUT&Tag和DAP-seq技术是近几年发展起来的新技术。CUT&Tag通过蛋白特异性抗体引导Protein A-Tn5酶在目标蛋白结合的DNA位置进行切割并且在序列两端加上测序接头，经过PCR扩增后形成可用于高通量测序的文库，随后对文库进行测序分析从而解析与目标蛋白结合的 DNA片段。

CUT&Tag技术不需要超声打断，也不需要传统的连接法添加测序接头，具有操作简便、周期短、信噪比高、重复性好、低细胞起始量等优势。但CUT&Tag比较适合组蛋白修饰的研究，部分转录因子有较好的实验数据。目前CUT&Tag在转录因子的应用上有一定的局限性。

ChIP-seq和CUT&Tag实验过程中都需要使用到抗体，首推商业化ChIP级别抗体/标签抗体。但许多项目存在无商业化抗体、目的蛋白低表达或染色质提取困难等问题，尤其是植物样本，那这种情况就可以考虑DAP-seq技术。

CUT&Tag技术原理

DAP-seq技术于2016年发表在Cell期刊，它是将蛋白质体外表达与高通量测序技术结合，使用体外表达的TF蛋白对裸露的全基因组DNA片段进行孵育，以确定结合序列。

主要步骤如下：

文库构建：提取基因组DNA，进行基因组DNA文库构建；
体外表达蛋白：利用HaloTag载体，将目的蛋白与HaloTag融合表达；
亲和纯化：将纯化的融合蛋白与基因组文库孵育。然后，通过HaloTag特异性磁珠，将目的蛋白和DNA复合物进行提取与纯化，随后捕获的DNA片段进行扩增，测序分析，探究目的蛋白结合的DNA片段。

DAP-seq技术是真核体外无细胞蛋白表达系统，主要为使用独特的技术去除了翻译抑制物的麦胚提取物，能够大量表达可溶性的全长蛋白。所以，该技术在植物样本研究转录因子与DNA互作的方向有天然的优势。

DAP-seq实验流程

◆ 小结：

» ChIP-seq：需要ChIP-seq级别抗体，对样本量要求高，适用于组蛋白修饰和转录因子;

» CUT-Tag：需要ChIP-seq级别抗体，对样本量要求低，更适用于组蛋白修饰;

» DAP-seq：无需抗体，采用无细胞植物麦胚表达系统，对样本量要求低，但适用于植物的转录因子。

二、研究思路

DNA蛋白互作组学的研究对象主要是转录因子和组蛋白，接下来，我们从这两个方向谈谈研究思路，希望能给大家提供新的科研思路和灵感。ChIP技术成熟稳定，适配的研究对象更多，所以举例时以ChIP-seq为主。

01 转录因子

转录因子调节基因的表达，无论是医学、动物还是植物领域都拥有重要的研究价值。

据报道，转录因子在癌症、自身免疫、糖尿病和心血管疾病等疾病中具有关键的生物学作用，因此它被认为是极具潜力的治疗靶点[2]。目前，转录因子小分子药物开发是一个新兴领域，前景不错。利用DNA蛋白互作技术探究转录因子调控机制，有利于疾病的诊断和治疗。

转录因子在植物体内普遍存在，参与环境应答反应。鉴于它在植物抗逆中的重要作用，很多项目以植物转录因子为研究对象，pubmed中植物转录因子的文章也在逐年增长中。

研究思路

· 探究下游靶基因的思路 ·

01 确定研究的主题

有了研究主题，就能确定研究材料。医学方向根据研究疾病类型选择合适的材料，比如健康vs病人组织，预后组织，小鼠模型或者细胞系等；植物处理前后、不同部位、不同时期、突变体VS野生型等组织；动物与植物类似。微生物也分处理前后菌株，突变体VS野生型菌株。在选材时，可以参考文献资料选择时期和取样部位等。

02 确定标记基因

大体上从两个方面展开：第一，参考文献中别的物种或组织中报道过功能的基因；第二，利用转录组测序寻找差异基因，筛选候选TF基因。

03 表达分析和功能验证

在研究样本中检测目的基因（文献或RNA-seq通常会提供多个候选基因）的mRNA和蛋白的表达情况。医学方向，预后和临床分析是比较常见手段。然后，对转录因子功能验证。医学方向通常选择细胞系/小鼠模型验证。植物和微生物，一般选择构建突变体。

04 寻找下游靶基因

ChIP-seq是利用染色质免疫共沉淀技术特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。这些DNA片段建库测序后，下机后得到的reads比对到参考基因，靶蛋白结合的DNA片段越多，那么会呈现reads显著性堆叠的区域，这个区域是peak区域。对peak的分析，可以分析关联基因以及motif。联合RNA-seq数据判断这些基因是否存在差异表达，从而推测靶基因。结合前期的功能实验，进一步判断基因的功能。

05 验证

对ChIP-seq结果进行验证，ChIP-qPCR、EMSA、酵母单杂等技术都是常用手段。证明转录因子确实与关键性的基因区域结合后，差不多一篇文章就到这里了。如果能进一步对发现的靶基因进行功能验证，那么文章会再上一个档次。

最后，通常会对结果进行推测，构建调控网络或模型。

02 组蛋白

组蛋白修饰常常被认为是基因表达的分子开关，介导可逆、可遗传调控，这种动态调控由相关酶进行控制，维持细胞稳态。这种稳态的打破在医学上会影响疾病的发生和进展，在植物上会影响生长发育和逆境胁迫。

组蛋白修饰的研究思路是先确定修饰类型。通常根据western blotting结果或文献资料，确定研究的物种/组织在组蛋白修饰水平上确实存在差异。

然后，收集样本进行ChIP-seq。样本选择和转录因子类似，组蛋白修饰的抗体都是比较常用的商业化抗体，在抗体这一部分难度少很多。技术上，选择ChIP-seq或CUT&Tag都可以。生信分析时联合RNA-seq，寻找组蛋白修饰影响的基因。这部分思路通过peak关联的基因寻找修饰水平和转录水平均下降的基因，进而挖掘调控基因/增强子。

最后，验证。通常用到的技术有ChIP-qPCR（调控基因）和荧光素酶报告基因（增强子启动子互作对）。功能验证与转录因子类似，选择细胞系、小鼠模型或突变体，然后对它们的表型或生理指标进行检测，从而确定靶基因的功能。

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参考文献：

【1】Pramanik D, Shelake RM, Kim MJ, Kim JY. CRISPR-Mediated Engineering across the Central Dogma in Plant Biology for Basic Research and Crop Improvement. Molecular Plant. 2021. 14(1): 127-150.

【2】Lee TI and Young RA. Transcriptional Regulation and its Misregulation in Disease. Cell. 2013. 152: 1237-1251.