SUPPA2 分析可变剪切

1、下载基因组转录本文件

以人类基因组转录本文件下载为例：
打开网站ensemble：http://asia.ensembl.org/index.html --> 点击 human

点击download dna fasta

点击划红线的部分，并下载到本地，之后上传到服务器中。

也可以在https://www.gencodegenes.org/mouse/ 网站中下载gtf文件和转录本fa文件

2、解压基因组转录本文件

gunzip Homo_sapiens.GRCh38.cds.all.fa.gz

3、转变为format文件

perl -lane 'if(/^>/){$id=(split/\./,$_)[0];print $id}else{print}' Homo_sapiens.GRCh38.cds.all.fa >Homo_sapiens.GRCh38.cds.all.format.fa

4、创建索引

#创建存放索引的文件夹
mkdir Homo_sapiens.GRCh38.cds.index#安装定量软件 salmon
conda install salmon#创建索引
salmon index -t Homo_sapiens.GRCh38.cds.all.format.fa -i Homo_sapiens.GRCh38.cds.index

5、使用salmon进行定量

#对单末端数据进行批量定量  （-r）ls *gz|cut -d"_" -f 1|sort -u |while read id;do(salmon quant -i /data/gs/data/data1/rawdata3/single/filter-adapters/single-porechop/nanofilt/salmon/Homo_sapiens.GRCh38.cds.index -l ISF --gcBias -r ./${id}_trimmed.fq.gz -o quants/${id}_output);done#对双末端数据进行批量定量
ls *gz|cut -d"_" -f 1|sort -u |while read id;do(salmon quant -i /data/gs/data/data1/rawdata3/single/filter-adapters/single-porechop/nanofilt/salmon/Homo_sapiens.GRCh38.cds.index -l ISF --gcBias -1  ${id}_1_val_1.fq.gz -2 ${id}_2_val_2.fq.gz -p 4 -o /data/gs/data/suppa/salmon_output/${id});done#这里定量的fq文件，是通过RNA-SEQ，过滤之后，得到的数据
#salmon也可以直接对sam/bam文件定量，参数为 -a
#salmon也可以直接使用fa文件进行定量，参数为 -t
#salmon使用索引进行定量，参与为 -i

6、提取salmon结果中的TPM值

multipleFieldSelection.py -i SRR*/quant.sf -k 1 -f 4 -o iso_tpm.txt

对tpm文件格式化：

perl -alne '{/(\|.*\|)\t/; ;s/$1//g;s/\|//g;print}' iso_tpm.txt > iso_tpm_formatted.txt

7、下载human的参考基因组注释gtf文件并处理为format格
式：（并解压）

http://ftp.ensembl.org/pub/release-100/gtf/homo_sapiens/

解压：

 gunzip Homo_sapiens.GRCh38.100.gtf.gz

8、使用generateEvents命令根据基因组的gtf注释文件生成
所有的可变剪切事件，格式保存为ioe格式（这一步为检测
gtf文件中的可变剪切事件有哪些）

#安装SUPPA
conda install -c bioconda suppa#计算gtf文件中的as事件
suppa.py generateEvents -i Homo_sapiens.GRCh38.100.gtf -o 107190A.events -e SE SS MX RI FL -f ioe

将不同的可变剪切事件合并成一个结果

vim ioe.awk
# 在vim脚本中写入（按i，即可将vim转变为可编辑状态）
awk 'FNR==1 && NR!=1 { while (/^<header>/) getline; } 1 {print} ' *.ioe > ensembl_mm10.events.ioe（输出文件名，可以修改）

:wq 保存退出 vim脚本
chmod 755 ioe.awk
./ioe.awk

9、计算psi值，根据tpm和gtf的ioe文件

需要注意的是使用的转录本ID和gtf的转
录本ID应该是一致，数目不一样可能会有错误提示:

suppa.py psiPerEvent -i Homo_sapiens.GRCh38.100.events.ioe -e  iso_tpm.txt -o SRR_events

10、差异可变剪切基因寻找

#1-56 这个数字为对照组的样本数量
#1-47 这个数字为实验组的样本数量
#这个数字根据自己的样本数据量设定
cut -f 1-56 SRR_events.psi > ./control.psi
cut -f 1-47 SRR1_events.psi > ./treat.psicut -f 1-56 iso_tpm_formatted.txt > ./control.tpm
cut -f 1-47  SRR1_tpm_formatted.txt > ./treat.tpmsuppa.py diffSplice -m empirical -gc -i /data/gs/data/data1/reference/gtf/Annotation/suppa/ensembl_mm10.events.ioe --save_tpm_events -p treat.psi control.psi -e treat.tpm control.tpm -o srr2_diffSplice

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