SMRT single molecular real time Sequencing
SMRT single molecular real time Sequencing
PacBio RS RS 表示 Real time Sequencing
4 月 18 日技术讲座第三代单分子测序 PacBio 技术及其应用进展
单分子测序的关键之一DNA 聚合酶
基本原理DNA 聚合酶和模板结合4 色荧光标记 4 种碱基经过 Watson 配对后不同的碱
基加入会发出不同光根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。这个 DNA 聚合酶是
实现超长读长的关键之一读长主要跟酶的活性保持有关主要受激光对它的损伤的影响。
PacBio 还在不断优化聚合酶的性能比如给聚合酶加上免受激光影响的保护基团等进一
步地提高读长提高测序质量和通量。
和其他基本测序技术一样在反应管中进行的是大规模平行的多分子反应怎样在其中
进行单分子反应检测周围有大量的荧光标记的游离碱基怎样将反应信号与周围游离碱基
的强大荧光背景区别出来
通过一个物理现象解释ZMWzero-mode waveguides零模波导孔。例如微波炉壁
上可看到有很多密集的小孔。小孔直径有考究如果直径大于微波波长能量就会穿透面板
泄露。如果孔径小于波长能量不会辐射外部可起保护作用。
同理在一个反应管SMRTCell单分子实时反应孔中有许多这样的圆形纳米小孔
即 ZMW零模波导孔外径 100 多纳米比检测激光波长小数百纳米激光从底部打
上去后不能穿透小孔进入上方溶液区能量被限制在一个小范围体积 20X 10-21 L里
正好足够覆盖需要检测的部分使得信号仅来自这个小反应区域孔外过多游离核苷酸单体
依然留在黑暗中将背景降到最低。
单个 ZMW 底部固定有一个结合了模板 DNA 的聚合酶当加入测序反应试剂后每个
碱基配对合成后会发出相应的光并被检测。一个 SMRTCell 中有 15 万个 ZMW每个孔中有
一个单分子 DNA 链在高速合成如众星闪烁。原始检测数据的结果每合成一个碱基即显
示为一个脉冲峰每分钟>100 个碱基的速度配上高分辨率的光学检测系统就能实时检
进行检测。
关键点之二荧光标记位点。这是影响测序长度的非常关键的因素。
二代测序都标记在 5‘端甲基上在合成过程中荧光标记物保留在 DNA 链上随 DNA
链的延伸会产生三维空间阻力导致 DNA 链延长到一定程度后会出现错读。这是 NGS 的测
序读长仅能达到 100 多 bp 到 200bp 的一个原因。
PacBio 平台的碱基荧光标记在 3‘端磷酸键。在 DNA 合成过程中正确的碱基进入时
在 3’端磷酸键的标记是会随磷酸键断裂自动被打断标记物被弃去亦即合成的 DNA 链
不带荧光标记和天然的 DNA 链合成产物一致可以达到很长的读长。
笔者疑问是不是 NGS 改用 5‘端标记就能实现延长读长
答首先荧光标记在 3‘端磷酸键是 PacBio 的专利。其它公司没法做。荧光标记位点仅
仅是影响读长的一个重要因素之一PacBio 的单分子实时测序反应是最接近天然状态的聚
合酶反应体系最大限度地保持了聚合酶的活性。NGS 测序反应原理不尽相同有的是焦
磷酸测序反应除聚合酶外有多种酶参与测序反应 要兼顾多种酶的活力并容非一件易的
事有的是通过添加保护基团来控制碱基的加入和检测通过淬灭试剂来消除背景荧光和保
护基团这些都增加了测序反应体系本身的复杂性此外NGS 每加入一种碱基或一个碱
基后都需要清洗步骤清除没有反应的多余反应物及反应产生的次级产物这都影响了聚合酶
的合成进程。
关键点之三时空段概念
合成过程中每次进入一个碱基原始数据会实时地产生一个脉冲峰每两个相邻的脉
冲峰之间有一定的距离也就是有一个时间段的概念。这个距离的长短与模板上碱基是否存
在修饰有关如果有碱基修饰就像开车经过路障时通过速度会减慢导致两个相邻峰之
间距离加大。根据这个距离的变化可以判断模板相应位点是否出现碱基修饰并且结果是
实时的。甲基化就是一种主要的碱基修饰PacBio 技术不仅可以提供序列信息还可提供
实时信息了解模板修饰的情况用于甲基化等碱基修饰研究。
二 测序流程和策略
配件SMRT cell chip小拇指指甲盖大小。一条 strip 可以放 8 个 SMRT cell仪器一次可
运行 2 条 strip共 16 个 SMRT cell
文库构建试剂盒测序试剂盒
流程和策略
1. 文库制备
材料全基因组 DNA或者 cDNA或者目标扩增产物
片段化全基因组太大需要片段化因为测序读长很长可以做很大的片段文库3-10kb
连接先把片段粘末端变成平端两端分别连接环状单链单链两端分别与双链正负链连接
上得到一个类似哑铃“套马环”的结构称为 SMRT Bell。连接半小时内完成。问题
片段化用什么方法两端的环状单链是同一序列吗如何确定单链方向如果两端一样如
何分辨正负链如何排除其他连接产物连接效率有多高如何纯化去掉酶答关于以上
文库制备问题跟 NGS 类似比如用片段化仪进行片段化加接头等等。通过优化的实验
protocol 进行各步骤的优化。
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