尝试做细菌完成图的你是不是有很多疑问

这份避坑指南请收好！

小坑1、“1 +X Contig，0 Gap”代表什么？

答：“1 Contig，0 Gap”的承诺保证了组装的完整性。但细菌基因组也存在多条染色体的现象，染色体本身又分线性和环状两种情况，受限于细菌本身客观情况的需要具体调整。凌恩生物超过几百个完成图的项目经验，多种微生物包含多个环、多个质粒，我们承诺都可以完成。。。

小坑2、致病菌可以做细菌完成图吗？

答：需要提供菌的拉丁名给公司进行确认，传染性太高的菌可能无法承接。

小坑3、细菌完成图的分析需要多长时间？

答：五个工作日。

小坑4、细菌完成图的结构注释包括哪些？

答：基因预测（gene、CDS、tRNA、rRNA、23S rRNA 、16S rRNA、5S rRNA 、miscRNA、tmRNA）；假基因预测；CRISPR 序列预测；基因岛预测；前噬菌体预测；重复序列预测；次级代谢基因簇预测。

小坑5、功能注释包括哪些数据库？

答：标准分析通用数据库（Nr、KEGG、GO、Swiss-Prot、COG、CARD、CAZy）及专有数据库（VFDB、PHI、Antismash、TCDB、ARDB、Pfam、CYP450）。

小坑6、做细菌完成图的DNA有什么要求？

答：DNA样品澄清透明，总量≥2 μg；

DNA纯度OD260/280在1.8-2.0之间；

DNA浓度≥10 ng/μL；

DNA完整无降解，无RNA、蛋白质等污染。

小坑7、需要提供什么样本？

答：提供单菌菌体样本。

菌体液体培养至对数期，OD600约0.6-0.8，收集菌体3-5ml，1.5ml离心管低温4度离心，弃上清，保留管底菌体。将离心管封口，立即液氮速冻，-80℃保存，干冰送至实验室。

注意事项：

1、不建议送平板和带液体培养基的，如有需求，请提前和实验室沟通。

2、一定是生长对数期的菌体；

3、细菌得率有高有低，细菌是经常提取不成功的一类物种，很大原因是菌体量过少。

大坑1、细菌基因组能保证完成图水平吗？

答：除以下情况之外，可以保证达到完成图水平，我们承诺100%项目获得完成图。

特殊情况如下：

a. 基因组大小>7M；基因组大小不限，最大基因组完成图14mb链霉菌；

b. 样品不纯（包括但不限于其它物种序列污染）；污染比例低于5%都可以承诺；

c. 染色体基因组个数＋质粒个数>4；

d. 转座子或其它重复序列在基因组中的比例异常高（>10%）；

e. 最长重复序列大于9K；

f. GC比例低于30%或高于70%。

以上情况特殊的项目，本公司项目经验丰富均可承接，并承诺组装做到最好。

大坑2、装出来的基因组的准确性怎么样？

答：由于HiFi数据兼具长读长和高质量的特性,在基因组组装中无需纠错,可实现基因组的快速组装,让基因组组装进入“高铁”时代。

大坑3、做完成图可以顺便做甲基化吗？

答：可以的，细菌完成图与细菌甲基化的实验流程是一致的，可以共用一份数据。要求数据量更高，推荐300x以上的覆盖度。

大坑4、是否能组装得到质粒？

答：可以的。我们承诺组装得到该菌株的全部质粒基因组。

天坑——如遇到菌株污染情况怎么办？

答：凌恩生物提供一代菌种鉴定服务，建议对待测样本先进行一代菌种鉴定，确认是单菌之后再进行后续实验及分析。如已进行了全部实验分析，发现有污染情况，可尝试通过加测数据量的方式使待测菌种达到目标深度，但依然建议在实验初期规避污染。

一般菌株污染情况包括种内污染和种间污染。首先，我们先搞清楚种内种间的概念。

• 种间：指不同物种种群之间的相互作用，属于不同物种；

• 种内：指同种生物个体之间的相互作用，属于相同物种。

如下图，沙门与大肠就属于种间关系，K-12和857C属于种内关系，其都属于大肠杆菌。

种内污染：相同物种、不同菌株混合在一起的样品，即下图中K-12与857C两个大肠菌株没有分离成功，而混合在一起抽提DNA，进行后续基因组组装的过程。

我们以三种常见的细菌作为测试对象：

• 李斯特菌：Listeria monocytogenes

• 沙门氏菌：Salmonella Heidelberg

• 大肠杆菌：Escherichia coli

（1）当单菌没有污染时，即不存在种内污染时，contigs数量最少，N50最长；

（2）当存在种内污染时，基因组总长度会变大，contigs数量明显增加，N50明显降低；

（3）质量的下降与污染比例呈现正相关，污染比例越高，质量越差。

种间污染：放入种间物种进行多角度分析，通常是两种情况，即基因组大小异常和单倍型丢失率。

（1）从基因组大小来看，种间还是影响更大（非常容易理解，污染了其他物种基因组，组装结果中拥有污染物种序列，明显会增大）；

（2）从单倍型丢失角度来看，种内物种的影响明显大于种间，尤其是污染超过20%以后，对于组装质量的破坏极其严重。

总结：种间污染不可怕，除了组装大小偏大，其他影响较小，而且可以通过生物信息方法排除污染，改善组装质量；但是种内污染比较麻烦，不容易排除污染，会让人束手无策，无法改善结果。

特别提示：

为确保实验的顺利，建议样品备份1-2份，以防备部分样品降解重新取材、制备或送样，耽误时间。

公司完成图

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（部分文章列表）

1. A novel ATP dependent dimethylsulfoniopropionate lyase in bacteria that releases dimethyl sulfide and acryloyl-CoA.Elife,2021.(IF=8.146)

2. The Second Chromosome Promotes the Adaptation of the Genus Flammeovirga to Complex Environments.Microbiol Spectr,2021.(IF=7.171)

3. Increasing prevalence of hypervirulent ST5 methicillin susceptible Staphylococcus aureus subtype poses a serious clinical threat .(IF=7.163),2021.Emerging Microbes & Infections

4. Genomic Investigation of Proteus mirabilis Isolates Recovered From Pig Farms in Zhejiang Province, China.Frontiers in Microbiology,2022. (IF=6.064)

5. Characterization of metabolite, genome and volatile organic compound changes provides insights into the spoilage and cold adaptive markers of Acinetobacter johnsonii XY27.LWT,2022. (IF=6.056)

6. Regulation of bla system in ST59-related oxacillin-susceptible mecA-positive Staphylococcus aureus.J Antimicrob Chemother,2021.(IF=5.79)

7. Tetracycline degradation by Klebsiella sp. strain TR5: Proposed degradation pathway and possible genes involved.Chemosphere,2020.(IF=5.778)

8. Complete genome sequence of the deep South ChinaSea-derived Streptomyces niveus SCSIO 3406, the producer of cytotoxicand antibacterial marfuraquinocins. Plos One, 2021. (IF=2.740)

9. Comparative genomic analysis of iprodione-degradingPaenarthrobacter strains reveals the iprodione catabolic molecular mechanism inPaenarthrobacter sp. strain YJN-5. Environmental Microbiology, 2020.(IF=4.933)

10. A novel strain of acetic acid bacteria Gluconobacteroxydans FBFS97 involved in ribofavin production. Scientific Reports, 2020.(IF=3.998)

11. An angular dioxygenase gene cluster responsible forthe initial phenazine-1-carboxylic acid degradation step in Rhodococcus sp.WH99 can protect sensitive organisms from toxicity. Science of the TotalEnvironment, 2020. (IF=5.589)

12. Novel Black Yeast-like Species in Chaetothyrialeswith Ant-associated Life Styles. Fungal Biology, 2020. (IF=2.789)

13. Assembly and analysis of the whole genome ofArthroderma uncinatum strain T10, compared with Microsporum canis and Trichophytonrubrum. Mycoses, 2020. (IF=3.065)

14.. Characterization of a Linezolid- andVancomycin-Resistant Streptococcus suis Isolate That Harbors optrA and vanGOperons. Frontier in Microbiology, 2019. (IF=4.259)

15. Population Structure and Antimicrobial ResistanceTraits of Avian-origin mcr-1-positive Escherichia coli in Eastern China, 2015to 2017. Transboundary and Emerging Diseases, 2019. (IF=3.554)

16. Emergence of plasmid-mediated oxazolidinoneresistance gene poxtA from CC17 Enterococcus faecium of pig origin. Journal ofAntimicrobial Chemotherapy, 2019. (IF=5.113)

17. Genome mining and metabolic profiling illuminate thechemistry driving diverse biological activities of Bacillus siamensis SCSIO05746. Applied Microbiology and Biotechnology, 2019. (IF=3.670)

18. Circulation and Genetic Diversity of FelineCoronavirus Type I and II From Clinically Healthy and FIP-Suspected Cats inChina. Transboundary and Emerging Diseases, 2019. (IF=3.554)

19. Comparative genome analysis reveals the evolutionof chloroacetanilide herbicide mineralization in Sphingomonas wittichii DC‑6.Archives of Microbiology, 2019. (IF=1.642)

20. Relationship between tetracycline antibiotic susceptibility and genotype in oralcavity Lac clinical isolates. Antimicrobial resistance and infection control,2019. (IF=3.568)

21. Complete Genome Sequence of Cd(II)-ResistantArthrobacter sp. PGP41, a Plant Growth-Promoting Bacteriumwith Potential in Microbe-Assisted Phytoremediation. Current Microbiology, 2018.(IF=1.373)

22. Characterization and heterologous expressionof the neoabyssomicin/abyssomicin biosynthetic gene cluster from Streptomyces koyangensisSCSIO 5802. Microbial Cell Factories, 2018. (IF=3.831)

23 Phylogeny of dermatophytes with genomic characterevaluation of clinically distinct Trichophyton rubrum and T.violaceum. Studies in mycology, 2018. (IF=11.663)

24. Genome Sequencing of Streptomyces atratus SCSIOZH16and Activation Production of Nocardamine via Metabolic Engineering. Frontier inMicrobiology, 2018. (IF=4.076)

25. Biodegradation of di-n-butyl phthalate (DBP) by anovel endophytic Bacillus megaterium strain YJB3. Science of the TotalEnvironment , 2017. (IF=4.610)

26. Deciphering the sugar biosynthetic pathway andtailoring steps of nucleoside antibiotic A201A unveils a GDP-L-galactose mutase.PNAS, 2017. (IF=9.423)

27. Biosynthesis of ilamycins featuring unusualbuilding blocks and engineered production of enhanced anti-tuberculosis agents.Nature Communications, 2017. (IF=12.353)

28. The complete genome sequence of Bacillus velezensis9912D reveals its biocontrol mechanism as a novel commercial biologicalfungicide agent. Journal of Biotechnology, 2017. (IF=2.533)

29. Comparative genomic analysis of isoproturon-mineralizing sphingomonads reveals the isoproturon catabolic mechanism.Environmental microbiology, 2016. (IF=4.974)