引言

bam文件

bed文件

bedGraph文件

R语言和linux实现从bedgraph到bam的转化

从bedgraph到bed

genome.size.txt

bed转bam

引言

Bam Bed bedGraph是保存测序数据的常用格式。在GEO数据库的文件中，很多都是用bed、bedgraph储存的，如何转变为更为下层的bam呢？，这里说一下如何从bedGraph转化成bam文件。

bam文件

第一列：QNAME
进行reads比对时通常表示reads的名字，如果这条reads比对到多条序列或比对到这条序列的多个位置，相同名字会出现多次。如果是pair-end reads，相同名字会出现2次，分别表示来自于R1文件的reads和R2文件的reads，如果其matepair reads也比对2个位置，也会出现2次，则相同名字共出现4次，如果一条reads也比对2个位置，则其matepair比对1个位置，则共出现3次，如果其matepair reads没有比对上序列也会出现1次（第三列显示“*”），所以pair-end测序，R1文件和R2文件同时mapping，相同reads的id最少出现2次。

第二列：FLAG
数值结果如下：
1（1）该read是成对的paired reads中的一个
2（10）paired reads中每个都正确比对到参考序列上
4（100）该read没比对到参考序列上
8（1000）与该read成对的matepair read没有比对到参考序列上
16（10000）该read其反向互补序列能够比对到参考序列
32（100000）与该read成对的matepair read其反向互补序列能够比对到参考序列
64（1000000）在paired reads中，该read是与参考序列比对的第一条
128（10000000）在paired reads中，该read是与参考序列比对的第二条
256（100000000）该read是次优的比对结果
512（1000000000）该read没有通过质量控制
1024（10000000000）由于PCR或测序错误产生的重复reads
2048（100000000000）补充匹配的read
具体的flag值的解释，可以参考samtools软件提供的结果
samtools（Version: 1.3.1）
其中的samtools flags用法可提供flag值的查找结果
About: Convert between textual and numeric flag representation
Usage: samtools flags INT|STR[,…]
例如：
samtools flags 10
0xa 10 PROPER_PAIR,MUNMAP（10=2+8）
samtools flags 12
0xc 12 UNMAP,MUNMAP（12=4+8）
具体的flag值的解释，也可参考如下网站：https://broadinstitute.github.io/picard/explain-flags.html
或者在必应当中搜索flag sam点击Explain SAM Flags-GitHub Pages进入该网页，也可以输入组合flag数值会出现所存在的意思

第三列：RNAME
表示read比对的那条序列的序列名称（名称与头部的@SQ相对应），如果这列是“*”，可以认为这条read没有比对上的序列，则这一行的第四，五，八，九列是“0”，第六，七列与该列是相同的表示方法

第四列：POS
表示read比对到RNAME这条序列的最左边的位置，如果该read能够完全比对到这条序列（CIGAR string为M）则这个位置是read的第一个碱基比对的位置，如果该read的反向互补序列比对到这条序列，则这个位置是read的反向互补序列的第一个碱基比对的位置，所以无论该read是正向比对到该序列，或是其反向互补序列比对到该序列，比对结果均是最左端的比对位置

第五列：MAPQ
表示为mapping的质量值，mapping Quality, It equals -10log10Pr{mapping position is wrong}, rounded to the nearest integer, A value 255 indicates that the mapping quality is not available. 该值的计算方法是mapping的错误率的-10log10值，之后四舍五入得到的整数，如果值为255表示mapping值是不可用的，如果是unmapped read则MAPQ为0，一般在使用bwa mem或bwa aln（bwa 0.7.12-r1039版本）生成的sam文件，第五列为60表示mapping率最高，一般结果是这一列的数值是从0到60，且0和60这两个数字出现次数最多

第六列：CIGAR
CIGAR string，可以理解为reads mapping到第三列序列的mapping状态，
对于mapping状态可分为以下几类：
M：alignment match (can be a sequence match or mismatch)
表示read可mapping到第三列的序列上，则read的碱基序列与第三列的序列碱基相同，表示正常的mapping结果，M表示完全匹配，但是无论reads与序列的正确匹配或是错误匹配该位置都显示为M
I：insertion to the reference
表示read的碱基序列相对于第三列的RNAME序列，有碱基的插入
D：deletion from the reference
表示read的碱基序列相对于第三列的RNAME序列，有碱基的删除
N：skipped region from the reference
表示可变剪接位置
P：padding (silent deletion from padded reference)
S：soft clipping (clipped sequences present in SEQ)
H：hard clipping (clipped sequences NOT present in SEQ)
clipped均表示一条read的序列被分开，之所以被分开，是因为read的一部分序列能匹配到第三列的RNAME序列上，而被分开的那部分不能匹配到RNAME序列上。
"="表示正确匹配到序列上
"X"表示错误匹配到序列上
而H只出现在一条read的前端或末端，但不会出现在中间，S一般会和H成对出现，当有H出现时，一定会有一个与之对应的S出现
例如：
162M89S
162H89M
149M102S
149H102M
40S211M
20M1D20M211H
S可以单独出现，而H必须有与之对应的S出现时才可能出现，不可在相同第一列的情况下单独出现
N：如果是mRNA-to-genome，N出现的位置代表内含子，其它比对形式出现N时则没有具体解释
M/I/S/=/X：这些数值的加和等于第10列SEQ的长度

第七列：MRNM
这条reads第二次比对的位置，在利用bwa mem产生sam文件时，如果该列是“”而
第3列RNAME不是“”则表示该reads比对到第3列显示序列名的序列上，而没有比对到其他位置，在利用bwa aln及bwa sampe比对生成的sam文件，如果和上述情况相同，则第7列为“=”，上述情况均表示该reads只比对到这一个位置
如果第3列RNAME和第7列MRNM都为“*”，则说明这条reads没有匹配上的序列，如果这条reads匹配两个序列，则第一个序列的名称出现在第3列，而第二个序列的名称出现在第7列

第八列：MPOS
该列表示与该reads对应的mate pair reads的比对位置，如果这对pair-end reads比对到同一条reference序列上，在sam文件中reads的id出现2次，Read1比对的第4列等于Read2比对的第8列。同样Read1比对的第8列等于Read2比对的第4列。例如：
第1列（Read id）····第4列（Read1比对位置）····第8列（mate-pair reads比对位置）
22699:1759····124057649····124057667
22699:1759····124057667····124057649
相同的reads id一个来自Read1文件，一个来自Read2文件，第4列和第8列是对应的

第九列：ISIZE

TLEN：signed observed Template LENgth （可以理解为文库插入片段长度）
如果R1端的read和R2端的read能够mapping到同一条Reference序列上（即第三列RNAME相同），则该列的值表示第8列减去第4列加上第6列的值，R1端和R2端相同id的reads其第九列值相同，但该值为一正一负，R1文件的reads和R2文件的reads，相同id的reads要相对来看。在进行该第列值的计算时，如果取第6列的数值，一定要取出现M的值，S或H的值不能取。
the unisgned observed template length equals the number of base from the leftmost mapped base to the rightmost mappedbase. Theleftmost segment has a plus sign and the rightmost has a minus sign

bed文件

bed文件一般代表区域信息，如表示peak位置的bed文件，表示基因注释的bed12文件。

表示基因注释时，gtf/gff和bed文件的区别

1）gtf/gff文件一行表示一个exon/CDS等子区域，多行联合表示一个gene；bed文件一行表示一个gene；
2）gtf文件中碱基位置定位方式是1-based（即起始的碱基记为1），而bed中碱基定位方式是0-based（即起始的碱基记为0）。

bed文件每一行对应信息

必须包含的3列信息：
1）chrom：染色体名字 (e.g.chr3, chrY, chr2_random或者scaffold10671)。
2）chromStart：基因在染色体或scaffold上的起始位置（0-based）。
3）chromEnd：基因在染色体或scaffold上的终止位置（前闭后开）。

可选的9列信息：
4）name：bed文件的行名。
5）score：本条基因在注释数据集文件中的评分（0-1000），在Genome Browser中会根据不同区段的评分显示对应的阴影强度（评分越高灰度越高）。
6）strand：链的方向+、-或. (.表示不确定链的方向)
7）thickStart：CDS区（编码区）的起始位置，即起始密码子的位置。
8）thickEnd：The endingposition at which the feature is drawn thickly (for example the stop codon ingene displays).
9）itemRgb：RGB颜色值（如：255,0,0），方便在GenomeBrowser中查看。
10）blockCount：bed行中外显子的数目。
11）blockSizes：逗号分割的列，数目与blockCount值对应，每个数表示对应外显子的碱基数。
12）blockStarts：逗号分割的列，数目与blockCount值对应，每个数表示对应外显子的起始位置（数值是相对ChromStart计算的）。

bedGraph文件

Genome Browser bedGraph Track Format
BedGraph格式文件，它是BED文件的扩展，是4列的BED格式，但是需要添加UCSC的Genome Browser工具里面显示的属性，一般就定义有限的几个属性即可。

BedGraph，它的trace type和Wig文件很像，不过后面的数据和bed文件很类似，后面的四列分别表示染色体序号，起始位置，结束位置和value值。

R语言和linux实现从bedgraph到bam的转化

从bedgraph到bed

以GSE139123举例，我们先下载你感兴趣的一个bedgraph文件，用R查看一下

1、GSE139123_CtrlA_peak.bedGraph放入你的工作目录

2、bedgraph<-read.table("D:/R/project_phenotypic_analysis/M6A-seq/source/GSE139123_CtrlA_peak.bedGraph")

3、View(bedgraph)

你可以观察到一共有四列，bedGraph至少有3列包含位置信息即可，第四行可要可不要。

然后直接存为Bed可以吗？答：不可以。完成如下操作才行

1、第一列改成chr1 chr10 X这样的染色体格式

2、取消行名列名

3、使用制表符\t隔开

4、删掉第一行，或者+#，这里在读取的时候把本来就有#的行干掉了，所以已经没有第一行了没在linux处理的时候，还是有的。

bedgraph<-read.table("D:/R/project_phenotypic_analysis/M6A-seq/source/GSE139123_CtrlA_peak.bedGraph")
bedgraph$V1<- str_c("chr", bedgraph$V1)
write.table (bedgraph,"c1.bed",col.names = F,row.names = F,sep = "\t")

genome.size.txt

保存为bed文件后，你还需要一个参考文件：genome.size.txt

genome size文件是为了最后一步转化为bam文件所必须的，samtools可以很简单的建立index文件

# Build genome index file
samtools faidx Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa

# Build the genome size file
awk {'print "Chr"$1,"\t",$2'} Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna.toplevel.fa.fai > Arabidopsis_genomeFile.txt

bed转bam

bedtools工具提供的bedtobam命令

大功告成。

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