悬浮细胞、淋巴细胞培养常见失败原因及解决方案

一、严格无菌操作　

对实验室以及培养过程中所接触的试剂、液体、器皿、仪器的消毒,均应严格按照有关细胞培养的参考书的要求进行操作。无菌观念要贯穿整个实验的始终,不可松懈。

二、培养器皿的选择　

淋巴细胞培养既可选择培养板(24 、48 、96 孔) 、培养瓶,也可选择三角烧瓶、试管等器皿进行培养。有研究表明提取的淋巴细胞用1. 5ml 离心管培养72 小时,细胞生长状况良好,细胞数与培养前比较,差异无统计学意义( P >0. 05) 。用青霉素小瓶进行培养,淋巴细胞生长也非常好。

可以认为,对散在的细胞培养来说,用小器皿具有以下优点:

(1) 便于操作:1. 5ml 离心管为一次性使用,青霉素小瓶可反复刷洗,而培养板、培养瓶价格偏贵且用过几次之后,便有些模糊不清,尤其是塑料的。更为重要的是,淋巴细胞培养为悬浮培养,在培养过程中需要不断晃动,而大多数实验室没有恒温摇床。我们发现,在培养过程中每隔6～8小时晃动一次培养器皿,便可解决这个问题。青霉素小瓶、1. 5ml 离心管晃动起来相对容易些。

(2) 减少污染:因为淋巴细胞培养的液体量较少,一般为100～ 200μl , 故文献资料中多见用培养板( 48 、96孔) ,少见用培养瓶。对分散的淋巴细胞培养,一方面一次用不了那么多孔,另一方面一旦一孔有污染,其他孔便有可能被波及,使其他孔的培养也失败。而且,晃动培养板时,很容易使液体溅到培养板盖上,增加污染的机会。而使用青霉素小瓶、1. 5ml 离心管等小器皿便可避免这些现象,但缺点是不易观察细胞生长,需取样加到载玻片上观察。

三、血清的选择

淋巴细胞对血清的要求较高,所以选用血清时要注意生产厂家。但胎牛血清价格昂贵,新生小牛血清或小牛血清也价格不菲,而使用自身血清不仅细胞长得好,而且更接近体内环境,避免了外来因素的干扰,使实验设计更严密。血清浓度在5 %～20 %时细胞生长比较好,当超过30 %时反而不利于细胞生长。

四、pH 值

细胞生长的最适pH 为7. 0～7. 2 ,可忍耐的pH 范围为6. 6～7. 8 ,当pH 低于6. 8 或大于7. 6 时, 都会抑制细胞生长。 RPMI1640 培养基加入血清后pH 值一般升高0. 2～0.4 ,故配1640 培养液及其他用液时使pH 值达到7. 2比较合适,并且需经常检测pH 值。

五、培养空间

培养液与液面上的空间二者的体积比例一般以1∶10 为宜,培养液液面高度最好维持在2～5mm 的范围,以便于气体交换。

六、恒温培养箱

温度应维持在37 ℃,CO2 浓度为5 % ,O2 为95 % ,100 %的饱和湿度。

七、常见失败原因　

1.　污染　

污染仍是细胞培养失败的主要原因,包括细菌和真菌,中药制剂尤易出现真菌污染。支原体污染不易发觉,但对细胞生长影响较小,尤其只培养72 小时。一般是分离过程中的用液和培养基出现了污染。

2.　pH 值　过高或过低,或培养过程中瓶塞不紧,CO2 逸出,导致pH 值上升。

3.　诱导剂淋巴细胞在体内外一般是不分裂的,在培养过程中须添加刀豆球蛋白(ConA) 、脂多糖(LPS) 、白细胞介素2 ( IL - 2) 、植物血凝素(PHA) 、丝裂霉素等促分裂剂和抗原物质。须注意它们的浓度及是否失效。

4.　培养器皿洗涤不干净　有蜡、油污或酸残留。

5.　培养用液含有杂质　配制过程中所使用的各种溶液必须用三蒸水,若含有Fe 、Ca 等离子及杂质,可影响细胞的增殖。

6.　接种的细胞数目过多或过少,或提取的淋巴细胞中混有大量红细胞。

7.　血清质量不佳。

8.　恒温培养箱的CO2 、温度等不稳定。

9.　存在个体差异　在相同条件下,某一受试者的血培养不成功,而对照实验培养结果正常,其原因有时无法查出.淋巴细胞的生长情况,还与受试对象的年龄有关,青年人的淋巴细胞比中、老年人的生长得要好。

解决方案：

CAR-T细胞等的体外扩增要达到临床使用数量的要求。大量的系统被使用，从简单的T型瓶到细胞培养袋再到复杂的生物反应器生产。理想的系统应具有密闭功能，减少污染的风险，因此大量的研究人员放弃了使用T型瓶。G-Rex是可伸缩的圆柱形静态培养设备，T细胞被培养在涉笔底部通气膜上，并且部分填充培养基。当细胞增殖时，用葡萄糖的消耗和乳糖产生测量培养基消耗。生长是可预期的，细胞可以用GatherRex（Wilson Wolf 生产）来收获。它是一个封闭系统设备，从培养物中提取上清。细胞通过旋转G-Rex来重新悬浮，GatheRex将悬浮和清洗的中间体收集到转移袋中，用于下游处理。

WWM的G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶是对传统细胞培养板、细胞培养瓶、细胞培养袋的开创性取代选择，克服了免疫细胞治疗（如CAR-T细胞）大规模应用的细胞培养障碍。

【G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶产品特点】
北京泽平代理的G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶为新型底透气培养瓶，专为悬浮细胞培养设计，氧气从底部透气膜渗透进入培养体系，细胞自然沉降至培养瓶底部，葡萄糖等营养物质自然对流至细胞，乳酸等代谢废物对流至上层，被大量培养基稀释。

G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶独特的结构，相对传统细胞培养瓶、细胞培养板、细胞培养袋，更利于细胞生长：
1、为细胞培养提供更好的氧气交换——G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶独特的气体交换膜为细胞提供均匀的透气膜平面，G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶独特的膜支撑结构使膜保持在水平位置；
2、为细胞培养提供更大来源的养分——G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶使用时培养基的液面很高，远超过普通培养瓶0.3cm或者培养袋1cm的限度；
3、为细胞培养提供良好的流通环境——G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶中细胞与氧气直接交换，二氧化碳直接排出不会影响细胞培养环境；同时，G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶培养基中的溶质通过自然对流可自由移动至细胞，不需要复杂的混合或灌注仪器。

【G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶产品优势】
1、节省培养基：使用G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶至少节省50%培养基；
2、节省耗材：最优培养条件下，只需使用1个G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶就能收获满足需求的细胞产品；
3、减少移液操作：简单的一次性加液操作，无需补液；
4、节省培养空间：一层培养箱可放16个G-Rex100细胞培养瓶；
5、收获细胞所需离心瓶少：最多可将90%培养基移除，相当于500mL培养基最终仅需使用1-2个50mL离心管即可完全收集。

【G-Rex 100透气性悬浮细胞培养瓶产品应用】
【应用一】封闭式培养系统——符合GMP要求的CAR-T细胞培养装置

1、一次性加入培养基，培养10天，细胞扩增100倍，不需要反复换液和操作细胞；
2、静置培养，普通的培养箱即可进行；
3、培养瓶与仪器配合，以半自动方式进行细胞回收；
4、生产CAR-T细胞与传统细胞培养方法相比，表达CD62L和CD25的比例更高，抗肿瘤活性更强；
5、封闭系统，满足GMP生产要求。

使用方法：

北京泽平科技专业各类细胞培养技术设备供应服务18年，欢迎微信搜索“泽平科技”进行咨询！

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