进化树构建－NJ法 V1.2

By ZHAO Yangguo, email: sunshine.zhao@yahoo.com.cn

通过长期的分析认为对于16S rDNA序列的进化(Phyligenetic tree)树建，采用NJ(Neighbor-joining)法更准确，而且相比其它方法速度较快。

在以前版本介绍中，我们以phylip中的软件包为例说明构建进化树的基本过程及评价方法，但由于方法较为复杂，应用受到很大限制。基于Mega 4.0(free of charge, )刚刚发布，我们将以此软件为工具进行系统发育树的构建分析，希望给广大初学者以帮助。

软件包下载网址：

Mega 4.0

Treeview:

1 序列的整理及相似序列的获得

将已测得的16S rDNA序列去掉载体序列后，全部改成fasta格式，并放到一个.txt文件中。如下所示：

―――――――――――――――――――――――――――――

>Eu-b1

AGAGTTTGATCCTGGCTCAgGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACgCGAAAGGGACTTCGGTCCTGAGTAAAGTGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTAGATAACCTGTCTTTGTGTCTGGAATAATACTTCGAAAGGGGTACTAATACCGGATAACCTTGCTTTTCACAAGTTATGCAAGCAAAGGTGGCCTCTGATACAAGCTACTGCATGAAGAGGGGTCTGCGTACCATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCCTACCTAGGCGACGATGGTTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGCACTGGAACACGGGCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGCGCAATGGGGGCAACCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGAGTGAGGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGTCAAGAGGAAAGAAGTGCATAATGGTTAATACCTGTTATGTTTGACGGTACCTCTAAAGGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAA

>Eu-b2

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAGAAGAGCTTGCTCTTCGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATACCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAA

TACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATC

AGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCTACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAA

GCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAA

――――――――――――――――――――――――――――――――――――

通过Genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)中的Blastn检测最相似序列或在GenBank中下载参考序列，选择。将上述序列粘贴到输入框中，如下图：

点击Blast，得到如下结果：

根据序列相似性大小，将相似性最大的序列下载下来：点击每个序列前方的连接，下载： 选择fasta格式，并下载下来，与原始文件放在一起形成一个文件，同时加上参考序列，在此我们加上大肠杆菌序列：

>Eu-b1

AGAGTTTGATCCTGGCTCAgGATGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACgCGAAAGGGACTTCGGTCCTGAGTAAAGTGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTAGATAACCTGTCTTTGTGTCTGGAATAATACTTCGAAAGGGGTACTAATACCGGATAACCTTGCTTTTCACAAGTTATGCAAGCAAAGGTGGCCTCTGATACAAGCTACTGCATGAAGAGGGGTCTGCGTACCATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCCTACCTAGGCGACGATGGTTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGCACTGGAACACGGGCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGCGCAATGGGGGCAACCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGAGTGAGGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGTCAAGAGGAAAGAAGTGCATAATGGTTAATACCTGTTATGTTTGACGGTACCTCTAAAGGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAA

>gi|45238864|gb|AY548775.1| Desulfobulbus sp. RPf35L17 16S ribosomal RNA gene gene, partial sequence

TTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGCGAAAGGGACTTCGGTCCTGAGTAAAGTGGCGCACGGGTGAGTAACGCGTAGATAACCTGTCTTCATGTCTGGAATAATACGCCGAAAGGGGTACTAATACCGGATATTCTTGCTTTTCATAAGTTATGCAAGCAAAGGTGGCCTCTGCATATGCTACTGCATGAAGAGGGGTCTGCGTACCATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCCTACCTAGGCGACGATGGTTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGCACTGGAACACGGGCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGAGGAATATTGCGCAATGGGGGAAACCCTGACGCAGCGACGCCGCGTGAGTGAGGAAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCTCTGTCAAGAGGAAAGAAGTGTACAATGGCTAATACCTGTTGTATTTGACGGTACCTCTAAAGGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTGTTCGGAATCACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCGGCTTGGTAAGTCAGATGTGAAAGCCCACGGCTTAACTGTGGAAGTGCATTTGAAACTGTCAGGCTTGAGTACCAGAGGGGAAAGTGGAATTCCCGGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATCGGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGCTGGATACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTGAACTAGATGCAGGGGGTGTTGATCCCTTCTGTGTCGCAGCTAACGCATTAAGTTCACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCCGGAAATCTTTTGGAAACAAGAGAGTGCTTCCATTCGGAAGAATCTGGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGCCTTTAGTTGCCAGCAGTTCGGCTGGGCACTCTAAAGGGACTGCCGGTGTTAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCTTTATGACCAGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGATACAAAGGGCAGCGACACTGCGAGGTGGAGCCAATCCCATAAAATCGGTCTCAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTCGGTTGTACCAGAAGCAGTTGAGCTAACCGCAAGGGGGCAGGCTGCCAAGGTATGGCTGGTAACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTA

>Eu-b2

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGATGAGAAGAGCTTGCTCTTCGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATACCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCTACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCATTAACCTAATACGTTAGTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAA

>gi|62465604|gb|AY972175.1| Pseudomonas putida strain P19 16S ribosomal RNA gene, partial sequence

CCTGTTTTGCATGCCGTCCCAAGCGGTCACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAAATCTCAAGGATTCCAACGGCTAGTTGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCGTACTCTAGCTTGCCAGTTTTGGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCCAACTTAACAAACCACCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAACACTAACGTATTAGGTTAATGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCATCTGATAGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTTCCTTTCGAAACGTTGTCCCCCACTACCAGGCAGATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTGAATCGAAGAGCAAGCTCTTCTCATCCGCTCGACTTGCATGTGTTAGGCCTGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCAGGATCAAACTCTGTTGCTAAAAAAAATTCCCGGA

>E.coli-M25588, 参考序列

AAATTGAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGCAGAAGGGCTTGCTGCTTTTGACGCTGGACGGCGAGTGTGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGGGGGGAGATGATAACACTTGGAAACGGTAGCTAATACGTGCATAATGTCGCAAGACCGAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGATGCCCAGATGGGATTAGGGGTAGCTAGTAACGAGTGGCTCACCTAGGCGACGATTCCAGCTGGTCTGAGAGGGATGACCAGCACCACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGTGCCGTATGAAGGAAGCCTTCGGGTTGTGAAGGGAGTAAAGTCTAATACTTTGCTCATTGTTACCCGACGCAGCGAAGAAGCCACGTACTTTCAGCGAGAGAAGGGGGGGTGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAGGTTAATCGCAAGCGTGGGCGGAATTACTGTAAAGCACGAGCGCCTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCCTAACCCTGGGAACTGCATCTGATACTGGCAAGCTTGTAGGTCTCGGAGAGGTAGAATTCCAGTAGAGATCTGGGGAATACCGGTGGCGGAAGCCCCCCTGGCGGACTGACGAAAGCTCAGGTGTGCGGGGGCATACTCCGCCGGTAGTCCACGTAAACGATGTCGTGGGGTGACTTGCCCCTTGAGGCGTGGCCTTCGAGGCGCTAACGTTAAGTCGCCTGACCCGGGGGGGTACGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATCGAATTGGGGGCCCGGAGCACAAGACGCATGATGTGCGTTTAATTCGCAACGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACCATCACGGAAGTGTTTTCAGAGATGAGAATGTGCTTCCGGGAACCGAGACAGCTGCATGGCTGTCAGGTCGTGTTGTGTTGCGAAATGGGTCCCGTTAAGTTGCCTGC

AACGAGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGGAACTCAAAGAGAGACTGCCAGCCGTCCGTGGATTAAACGAGGGGGGGAAGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCCCTTCACGACCAGGGCACACACTGTGCTACAATGGCGCATCACAAAGAGAGCGACTCCCGCGAGAGCAAGCGGATCTCATAAAGTCGTGCGTAGTCTGAGGTCCGGATTGCTAACCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTGTAATCGGATCCAGAATGCACCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACGCCCCGTCACACCATGGGGTGGAGGTGACTGTGGGTTGATATTCGTCCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCTTACCACTTTGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTA

2 进化树构建及评价

打开软件

Mega 4.0,如下图所示：

首先必须对获得的序列进行对齐，该软件集成了Clustal W，所以可直接通过Mega 4.0进行序列的对齐。

选择AlignmentÆAlignment Explorer/CLUSTAL, 将刚才获得的Fasta格式的序列，直接粘贴进去(Crl+C, Ctrl+V)，或将获得的序列存在文本文件中后(扩展名为*.fas)，打开。如下

图所示。

序列文件打开后，结果如下图：

直接选择Alignment/Aign by Clustal W,如下图所示：

对齐结果如下图所示：

通过点击序列上方空格，以及与shift键的综合使用，去掉两端不齐序列，保存成*.mes 和 *.meg文件，如sequence.meg。

回到mega 4.0初始界面，将刚才保存的sequence.meg打开，如下图所示。

在主程序中，选择Phylogeny/Bootstrap Test of Phylogeny/Neighbor-Joining；当然也可以直接采用Phylogeny/Construct Phylogeny/Neighbor-Joining(不带Bootsrap评价)，如下图所示。

根据要求，可以更改Bootstrap重复次数，以及其它参数。这里，我们将其改为1000次。

点击：Compute

,很快树就出来的，而且还带有必需的支持率,可以改变树的不同显示方式。

100620.80.70.60.

50.40.30.20.10.0

由于进化树图谱的分辨率较低，而且，部分内容还需修改，所以建议采用拷贝的方式,通过photoshop增加分辨率及丰富其内容.

我们将通过该软件绘制的进化树,同以前Phylip软件包绘制的进化树进行对比,基本没有太大变化(无根树是一致的，外族选择不同，导致其它变化),而且树形更加美观. 下图是采用Phylip绘制的进化树，参见之前版本。

当然，进化树构建软件越来越多，应该选择知名度高，被广泛接受的软件进行画图，这样才容易被人认可。