1 文章亮点

【1】 分离培养了289种根际细菌，并对其中的39个进行基因组测序，为根际微生物组装模式的研究奠定了基础。

【2】 代谢组学的应用促进了对根际分泌物成分的解析，并将代谢物和分离培养的微生物相关联，将39个分离微生物分为对根际的阳性应答者和阴性应答者（在根际是否富集）。

【3】通过对不同响应类型的微生物基因组进行功能分析，阳性应答者具有更慢的生长速度、更多的有机酸、氨基酸转运基因；阴性应答者具有更高丰度的碳水化合物酶编码基因。

2 摘要

像所有高等生物一样，植物在微生物世界的背景下进化，塑造了它们的进化特征和当代生态适应性。植物根系和土壤微生物之间的相互作用对于植物在自然环境中的适应至关重要。鉴于这种共同进化和植物-微生物相互作用的重要性，有人假设，植物可以调节根际分泌物的组成，以促进微生物的生长，从而提高植物在特定生态系统中的适应性。在这里，利用比较基因组学和代谢组学的结合，我们表明植物(燕麦)的发育过程导致根分泌物化学组成的一致模式。根际的这种化学演替与微生物代谢物底物偏好性相互作用，这种偏好性可以从基因组序列中预测。具体来说，我们观察到根际细菌偏好性利用植物分泌的芳香有机酸(烟碱、莽草酸、水杨酸、肉桂酸和吲哚-3-乙酸)。这些植物分泌特性和微生物底物吸收特性的组合相互作用，形成了根际微生物群落的组装模式。这一发现为根际微生物群落的组装过程提供了一个机制理解，并为操纵根际微生物群落提供了一个有吸引力的方向。

3 研究背景

土壤中植物根生长的周围区域(根际)是生物地球化学转化的一个关键热区，它是土壤形成、碳循环和地球陆地生态系统最终生产力的基础。在根际，植物和生物网络，特别是微生物之间形成了复杂而动态的相互作用，其是由超过4.5亿年的共同进化形成的。“根际效应”描述了生长根附近微生物细胞的富集和活性，并已被证明涉及系统发育相关微生物的“选择”，不同物种、地理位置、气候和土地管理的植物显示出不同的根际微生物。在不同生态系统中，也观察到了一些一致的趋势，例如，据报道，在各种植物的根际土壤中，α变形菌亚门的细菌数量增加了。相反，放线菌的数量在发育的后期减少了。已经确定了几个与根际富集相关的特定特征，例如分泌系统的存在、粘附、噬菌体防御、铁动员和糖转运。显然，根际微生物群落结构是植物根、微生物和土壤的物理和化学环境之间一系列复杂的相互作用和反馈的结果。然而，尽管越来越多的研究表明植物发育影响土壤微生物群的组成及其功能，但相对较少的研究试图了解动态植物渗出在根际微生物群建立中的作用的分子和化学基础。

植物分泌出大量(11-40%)光合作用产生的碳，创造了一个多样化的化学环境。渗出的化合物包括糖、氨基酸、有机酸、脂肪酸和次级代谢物。根系分泌物的组成不是均匀的或静态的，而是根据植物种类、发育阶段、根系特征、环境条件、营养和土壤类型以及其他因素而变化。释放的化合物已被证明能招募有益的微生物并影响根际微生物群的聚集，从而增强植物适应环境的能力。

许多研究已经证明了小信号分子(包括酰基高丝氨酸内酯、类黄酮和非蛋白原性氨基酸等)、聚合物、抗菌剂或植物激素(如水杨酸)对根际植物和微生物之间相互作用的影响；然而，这些化合物仅代表一小部分渗出的代谢物。目前还不清楚根系分泌物化学和微生物底物偏好性之间的相互作用是如何塑造微生物群落的。分泌物成分的动态与特定土壤微生物的生长有关系吗？如果是，那些关系可以预测和概括吗？

为了解决这种不确定性，我们整合了来自比较基因组学和代谢组学方法，以探索土壤细菌的代谢潜力、一年生草在其发育阶段产生的根分泌物的组成以及代表对生长的植物根表现出不同演替响应的群体的分离的土壤细菌的底物吸收偏好性。我们假设根际富集的细菌相对于那些不富集或对生长的植物根响应衰退的细菌有不同的底物偏好性。我们证明，根际细菌的生长响应可以用它们预测和观察到的底物偏好性和根分泌物的化学组成来解释，从而提供了通过分泌物的特定组成直接操纵土壤微生物的证据。

4 主要结论

4.1 燕麦生长过程中根际细菌的演替

“根际效应”已在无数植物物种和土壤类型中观察到。土壤代表了一个潜在生物的种子库，这些生物可能会因生长中的根分泌的资源而茁壮成长。大量研究表明根际选择是非随机的，具有一些明显的系统发育保守性。这表明植物正在选择特定的遗传特征，可能是通过根区的化学修饰。在这里，我们研究了土壤微生物对燕麦根系生长响应的机制。我们使用具有一定浓度范围、营养物质、抗氧化剂、维生素和辅助因子组成的培养基，以及延长的培养时间，从燕麦占优势的草原土壤中分离出289种异养细菌，并对其进行系统发育特征分析(图1)。这些分离微生物代表七个门，主要来自已知在该土壤中占优势的放线菌和α变形菌。根据培养基成分不同，分离回收率也不同(图1)，这表明从不同的生态位选择微生物。在这些分离微生物菌株中，基于它们在土壤中的相对丰度和它们的系统发育，选择了39个进行全基因组测序(补充图1-3和补充数据1)。与这39个分离微生物菌株相匹配的非冗余OTUs总共代表了10-12%的总细菌群落。其中17个在该环境中具有超过总细菌群落1%的相对丰度(补充图2和补充表1)。

这些具有测序基因组的细菌分离微生物与16S rRNA基因OTUs相关，其演替动态先前已经在根际微宇宙实验中确定，其中根际土壤在燕麦生长的0、3、6、9和12周取样(补充图2)。基于这一分析，分离微生物被分为不同响应组(图2)。第一组(n = 19)包含对植物生长有响应的相对丰度增加的分离微生物(“阳性应答者”；Positive responders)，第二组(n = 8)包含在植物生长期间相对丰度下降的分离微生物(“阴性应答者”；Negative responders)。应该注意的是，虽然相对丰度的变化可以解释为相对适合度的变化，但它们可能是由于其他群落成员的减少或增加，而不是“响应”微生物绝对丰度的变化。其余的分离微生物菌株在12周内相对于土体土壤的相对丰度没有显著变化，被称为“不确定应答者” （Undefined responders)。阳性响应组包括与变形菌(冬氏菌、红螺菌、鞘氨醇单胞菌、中根瘤菌、慢生根瘤菌、茎杆菌、伯克霍尔德氏菌、变异菌和假单胞菌)相关的分离微生物菌株和少量的放线菌(分枝杆菌和链霉菌)。阴性响应组的分离微生物主要来自放线菌和厚壁菌(芽孢杆菌和类芽孢杆菌)。一般来说，放线菌的相对丰度下降，而变形菌，尤其是α变形菌的相对丰度在植物生长过程中增加。这一观察结果与许多其他演替研究一致:包括拟南芥、小麦、水稻和玉米，表明在植物物种和土壤类型根际微生物群落的重组中存在一定的保守性。

Fig. 1 | Cladogram showing phylogenetic relationships between 289 soil heterotrophic bacterial isolates and their origin (media type). Leaf labels indicate representative sequence IDs. Rings, from the inner to the outside circles, represent: (1) genome-sequenced isolates (black blocks); (2) class-level taxonomy of isolates; and (3) the medium on which isolates were originally obtained.

4.2根际环境中分离微生物的功能

基于16S rRNA基因序列的相对丰度，大多数被归类为阳性应答者的细菌可能与以前已知的与根际相关的分类群有关，并且在某些情况下，促进植物生长。在众多研究中对这些植物分类群的一致观察再次表明，进化遗产是由有利于根际生活的遗传特征驱动的。为了鉴定这些特征，我们分析了它们的基因组，发现了对根际生长和土壤有机质转化都很重要的特征(图3a-d)。具体来说，除了预测的生长速度之外，我们还关注了与获取碳底物相关的特性，如大分子解聚酶和单体转运。我们分析了这些特征在细菌根际响应群中的分布。

与我们的预期相反，大多数对植物生长表现出积极响应的细菌根据密码子使用偏好性被预测具有更长的世代时间，这意味着它们的基因组带有生长速率较慢的特征(图3a和补充图3)。这一预测通过大多数分离微生物菌株的实验室生长率实验得到证实(补充图4)。

底物偏好性可能赋予根际的选择性优势，事实上，阳性和阴性应答者在利用有机酸的代谢潜力方面存在差异(图3d)。经基因组大小校正后，编码有机酸转运蛋白的基因在阳性应答者中明显多于阴性应答者(图3d)。同样，氨基酸转运蛋白的数量也在对根生长有积极响应的细菌中有着较高丰度。相反，编码糖苷水解酶(GH)(主要是β-葡糖苷酶(GH1、GH3和GH5)、β-木糖苷酶(GH43)、β-葡聚糖酶(GH16)、β-半乳糖苷酶(GH2)、葡糖淀粉酶(GH15)、α-葡糖苷酶(GH13)和α-N-乙酰半乳糖胺酶(GH9)的基因在阴性应答者的基因组中更丰度更高(图3c)，这些基因可能更好地适应生活在容易接近和同化底物的活根区之外(图3c和补充数据2)。总之，这些结果表明，阳性和阴性应答者的基因组中有一些特征，表明这两组之间底物利用的潜力存在差异，并且它们在土壤中占据不同的生态位。虽然基因组学可以暗示假定的代谢功能，但这些由基因组分析预测的功能是需要实验证实的假设。为了确定在根系分泌物中发现的吸收底物类的基因组功能潜力和从分泌物生长培养基中吸收这些底物之间是否存在关系，我们使用了代谢组学方法。

Fig. 2 | Growth response in the soil of bacterial isolates to Avena growth based on changes in 16S rRNA gene abundance. Each bar represents the change (Δ) of isolate abundance between bulk soil at week 0 and the point of maximum change over the developmental stages of Avena. Δ of isolate abundance was normalized by the total number of 16S rRNA reads identified for each isolate over all developmental stages of Avena.

4.3植物发育过程中野燕麦根系分泌物代谢产物的分析。

根系分泌物特定成分的代谢潜力的差异表明，与此相关的特征可能对根际细菌的演替很重要。因此，植物分泌物的化学组成可能是塑造根际微生物组成的关键因素。植物通过它们的根分泌一种化学物质的混合物，这种混合物在植物的不同发育阶段和营养状态下有不同的组成；因此，我们分析了分泌物在其整个生长阶段的组成。出于几个原因，我们选择使用水培系统来分析燕麦分泌物化学的动态变化。使用水培法是一种权衡，因为植物在水培中的功能与真正的土壤系统不同；然而，水培法允许精确控制植物生长的化学环境，便于收集足够量的新鲜产生的分泌物，避免与分泌物成分的不均匀矿物吸附相关的问题，并且可以最小化渗出的代谢物的微生物转化。接下来，我们使用液相色谱-质谱(LC-MS)技术评估了不同发育阶段分泌物的组成。这表明分泌物包含广泛的代谢物，包括糖、糖醇、核苷酸、核苷、氨基酸、有机酸、脂肪酸、植物激素和相容溶质(图4和补充数据3)。早期发育阶段(第3周)的代谢物谱不同于第6周和第9周的代谢物谱，不同于对应于衰老的晚期发育阶段(第12周)(图4a)，而6周和9周龄燕麦的分泌物代谢物谱相似。

然后，我们测定了随着燕麦的发育而丰度发生显著变化的代谢物(图4b和补充图10)。在早期发育阶段(第3周)，蔗糖和高丝氨酸的浓度相对于其他发育阶段更高(图4b)。蔗糖是根皮中发现的主要糖，它可以分配到根尖，随着根的成熟而减少。在根生长的早期发育阶段，蔗糖被认为是共生植物-微生物相互作用和潜在植物防御机制发展的重要因素。

Fig. 3 | Distributions of select traits in the genomes of soil bacterial isolates classified into two groups based on the response to plant root growth.a, The minimum generation times predicted from genome sequences. b, Genome size of isolates. c, Extracellular enzymes for plant polymer degradation. d, Monomer transporters.

第6周和第9周，处于A. barbata的营养发育阶段，与其他阶段相比，表现出最高的分泌物总释放量(图4b)。在第3周、第6周和第9周之间，具有芳香环的氨基酸和羧酸显著增加(图4b和补充图10)。植物以异养生物的信号分子和碳源的形式释放各种芳香化合物，作为抵御病原体的机制。燕麦根际土壤中芳香化合物(香草酸、丁香酸、香草醛和阿魏酸)释放量的增加是野燕麦根化感作用的潜在机制。然而，它也可能与根际微生物的生理学有关。

在植物衰老期间(第12周)，观察到季铵盐(甜菜碱、甜菜碱和水苏碱)和植物激素(吲哚-3-乙酸(IAA)和脱落酸(ABA))的丰度显著增加。水苏碱(l-脯氨酸甜菜碱)和吲哚乙酸在燕麦发育过程中变化最显著(分别为170倍和40倍变化)(补充图10)。甜菜碱在植物中广泛存在，是对各种环境压力作出响应而产生的，以保护细胞膜、酶活性和调节活性氧物质的解毒作用。有人认为脱落酸作为一种促进衰老相关过程的应激响应代谢物，在植物代谢中起作用。据报道，吲哚乙酸可延缓和促进植物衰老，过量的吲哚乙酸和脱落酸可抑制根的生长。这些结果表明，这些代谢物以遗传的方式随根生长和植物发育阶段而变化，并表明分泌物代谢物组成随时间的变化可能有助于根际微生物群落中观察到的演替模式(图2)。

Fig. 4a | Changes in A. barbata exudation through plant development (weeks 3, 6, 9 and 12). a, Principle component (PC) analysis of the exudate profiles of A. barbata at each time point (n= 16 exudate profiles).

虽然在我们的研究中，我们能够检测和识别植物分泌物中存在的大量代谢物，但仍不清楚单个化合物反映了分泌物总碳含量的哪一部分(未检测到的代谢物和较大的水溶性聚合物仍未知)。因此，尽管特定代谢物可能会显著增加，但重要的是要注意，它可能仅占总分泌物碳库的一小部分。

Fig. 4 | Changes in A. barbata exudation through plant development (weeks 3, 6, 9 and 12).b, Changes in the abundance of each exudate compound across plant developmental stages (n= 16 exudate profiles).

4.4 根际分离细菌对根系分泌物的代谢

为了确定土壤细菌对底物的偏好性是否与根系分泌物的化学成分相互作用，从而影响微生物的演替模式，我们选择了分离微生物作为对植物生长的阳性和阴性响应组的代表(图2)。我们使用代谢组学方法确定了这些分离微生物菌株对底物偏好性的差异。这些分离微生物菌株在含有汇集分泌物的培养基中培养，分泌物在燕麦不同发育阶段收集，通过液相色谱-质谱测定从培养基中摄取特定化合物。代谢物摄取表示为与对照未接种培养基相比，每个分离微生物菌株从培养基中利用的代谢物的百分比(补充数据4)。这种代谢组学方法特别允许在微生物面临分泌物混合物中的底物选择时评估底物的偏好性，这与单独评估底物利用的其他方法形成对比。

根分泌物代谢物分为六个化学类别，包括氨基酸(含氨基的有机酸)、核苷酸和核苷、糖、有机酸(不含氨基的有机酸)、季胺和脂肪酸。在根生长过程中被富集的分离微生物显示出对氨基酸、有机酸、糖和季胺的显著更高的吸收(图5)。阳性和阴性应答者在有机酸和氨基酸在之间的摄取上显示出最显著的差异。相反，阳性响应者的分离微生物菌株比阴性响应者的分离微生物菌株对核苷酸和核苷的摄取更低。

这些对氨基酸和有机酸吸收增强的观察证实了我们的发现，即根际富集细菌在其基因组中编码的有机酸和氨基酸转运蛋白的数量比响应根生长而下降的细菌多(图3d)。这有力地证明了根际细菌从分泌物混合物中选择性吸收有机酸与植物生长营养阶段这些化合物的增强释放相互作用。有机酸对植物-微生物相互作用的重要性的这一观察已经在前面中提到过。例如，添加有机酸作为单一底物显著提高了假单胞菌对番茄根的定殖。

对分离微生物菌株吸收根分泌物代谢物的进一步分析(补充图11)表明，大多数根分泌物代谢物的吸收在分离微生物菌株之间是相似的，所有分离微生物菌株都吸收了大部分主要的蛋白原氨基酸、核苷酸和糖。然而，不同分离微生物菌株对特定有机酸、脂肪酸和季胺的吸收差异很大(补充图11)。同一类别的代谢物，特别是氨基酸、核苷酸和芳香族有机酸，形成簇，表明不同分离微生物菌株对同一化学类别中的化合物的摄取模式相似。

然后，我们分析了根系生长阳性和阴性响应者对根系分泌物代谢物吸收的显著差异。我们发现，分离微生物菌株利用的101种代谢物中，有32种在这些分离微生物菌株组中表现出显著差异(P < 0.05)，13种代谢物在阳性和阴性应答者之间的代谢物摄取差异超过20%(图6a和补充图11)。分离微生物菌株之间底物偏好性的最显著差异(培养基中代谢物利用的百分比)由芳香族有机酸(烟酸、莽草酸、水杨酸、肉桂酸和吲哚-3-乙酸)的聚类来定义(图6b和补充图11)。对根有积极响应的分离微生物菌株比那些对生长的根有消极响应的分离微生物菌株从培养基中利用具有芳香环的有机酸的代谢物的百分比高48%。

这些根分泌物成分已被证明会影响根际微生物群的组成。例如，水杨酸是植物新陈代谢的关键调节剂，它能诱导植物产生系统抗性，从而抑制病原微生物的生长。结合我们的观察，似乎优先利用水杨酸的能力可能是根际细菌的一个显著特征。我们还观察到，阳性应答者对几种戊糖的摄取百分比高于阴性应答者，但相反，我们发现核苷(胞苷、鸟苷和胸苷)更容易被阴性应答者摄取(图6a)。基于它们对底物的利用，导致根际土壤细菌之间的生态位分配。

Fig. 5 | Distributions of root exudate metabolite uptake by isolates presented as the per cent uptake from the exudate medium. In each box plot, a point denotes a single metabolite and its per cent uptake in a single incubation.

4.5基于分泌物成分和底物偏好性预测微生物对根生长的响应

我们使用根际分离微生物相对丰度的数据和它们的分泌物代谢物摄取偏好性来建立主成分回归模型，以预测微生物对植物发育的响应(补充图12)。该模型确定了外源代谢物资源和微生物响应根的生长之间的强关系。尽管用于主成分回归的观察结果数量有限，但能够使底物偏好性驱动阳性和阴性应答者分离的预测代谢物与我们研究中通过其他方法鉴定的代谢物一致(图6)。

该主成分回归模型然后被用于预测四种细菌分离微生物对植物生长的响应，仅仅基于它们测量的代谢物摄取偏好性(补充图14b)。这四个根际分离微生物的16S rRNA基因相对丰度随植物生长而变化；然而，这些变化并不显著，这些分离微生物菌株被归类为“不确定应答者”(图2)。我们使用这些分离微生物的底物吸收偏好性作为预测因子来确定它们在根际的行为。根据预测模型，拟诺卡氏菌HA20对根生长显示出假定的阴性响应，微杆菌HA36、黄杆菌HB58和纤维素单胞菌HD24被鉴定为阳性响应者(补充图14b)。预测响应证实了由16S rRNA基因丰度模式指示的对植物发育的拟定响应；这表明代谢物吸收特性可能是根际定殖的特别有价值的预测因子。

Fig. 6 | Substrate preferences of positive and negative responders. a, Metabolites with significant differences in their uptake from Avena exudates by isolates (n= 12 isolates) (P< 0.05, Kruskal–Wallis test; see Supplementary Data 4 for details). b, The uptake of aromatic organic acids from exudate media by isolates with positive (n= 8 isolates) and negative (n= 4 isolates) responses to plant growth.

5 参考文献

Zhalnina, Kateryna; Louie, Katherine B.; Hao, Zhao; Mansoori, Nasim; da Rocha, Ulisses Nunes; Shi, Shengjing; Cho, Heejung; Karaoz, Ulas; Loqué, Dominique; Bowen, Benjamin P.; Firestone, Mary K.; Northen, Trent R.; Brodie, Eoin L. (2018). Dynamic root exudate chemistry and microbial substrate preferences drive patterns in rhizosphere microbial community assembly. Nature Microbiology, (), –. doi:10.1038/s41564-018-0129-3

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