16S rdna 菌种鉴定
一、为什么选择16S rdna进行菌种鉴定:
细菌的rRNA是细胞内含量最多的RNA,约占RNA总量的80%以上,由高度保守区和可变区组成。
细菌的rRNA包括5S、 16S、 23S,其中5S rRNA信息量少,不适合分析。23S rRNA尽管分子大,信息量多,但碱基突变速度较快,同样不适用于细菌鉴定。16S rDNA 是编码原核生物核糖体小亚基rRNA(16S rRNA)的DNA序列,相比之下遗传较为稳定,长度在1500bp左右,代表信息量适中,可以用于研究系统进化。目前已经报道了10,000种以上的细菌16SrDNA序列。
二、16S rdna 菌种鉴定详细实验流程:
1.PCR扩增模板获取:
a.菌落热裂解液:挑去取单个菌落到无菌水中,沸水中孵育10min;涡旋震荡后短暂离心取1ul作为PCR模板(方便快捷,但产物不纯)
b.用常规的基因组DNA提取试剂盒提取细菌基因组DNA(可以获得高质量的DNA模板)
2.PCR扩增(具体体系及程序根据用的PCRmix而定)及一代测序,所用引物如下:
2 7F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT
3.一代测序序列与数据库比对,确定细菌种属:
网站:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
a.打开NCBI网站,比点击网站底部"BLAST"项:
b.单击“Nucleotide BLAST ”
4.把测序得到的序列复制进左上方的搜索框内;
并把数据库选定为“rRNA/ITS databases”;
如下图标红部分:
5.点击页面左下方的“BLAST”选项:
6.比对的结果会根据符合度从高到低显示,如示例序列鉴定到的最符合的菌种为“Bacillus safensis”:
PS:如期项目手册走一波:
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