高效提取分离细菌内膜和外膜蛋白
本文来自学习一篇科研论文：Systematic Localization of Escherichia coli Membrane Proteins
目前研究细菌内外膜蛋白大多是采用预测的方式，经常出现不准确的结果。蔗糖密度梯度离心是分离内膜蛋白和外膜蛋白非常有效的方法，其中外膜蛋白通常由两亲性的beta-绳索结构进而形成beta筒状结构，通过N端脂质化的半胱氨酸残基绑定到细胞外膜上。
细菌外膜蛋白提取步骤：
1、培养2L 细胞至OD600=0.8-1.0，7000rpm，离心10min收集细胞，用20ml 冰冷的 20% 蔗糖溶液（10mM pH 8.0的Tris溶液，添加 50ug/ml 的DNase I）重悬细胞，室温下孵育15 min。
注意：细胞在20%蔗糖溶液中会冻住来增强裂解，而且20%蔗糖溶液促进细胞质壁分离，更有利于分开细胞的内膜和外膜。
2、法国压力细胞压壶用15000psi压碎细胞两次，like将压碎的细胞转移到冰上抑制蛋白酶的活性。
3、3000rpm，4℃，10 min 离心去除细胞碎片
4、（一步蔗糖梯度提取法）。
5、对于外膜和内膜的粗分离，采用两步梯度法：
SW41 转子 SW27/8转子
4 ml 70% 蔗糖 14 ml 70%蔗糖
4 ml 60%蔗糖 14 ml 60%蔗糖
4 ml 样品（20% 蔗糖） 9 ml 样品（20% 蔗糖）
调节70%的体积填满离心管 可以用50%蔗糖代替60%蔗糖提高外膜的产率
6、 SW 41转子中 4 ℃，39 000 rpm 离心 4h或过夜，或者SW27/8转子中4℃，23000rpm离心过夜。
7、两步梯度离心后应该会出现两层。上层应该为微红色，下层为白色。外膜在下层中。外膜应该在60%和70%连接处，内膜应该在20%和60%连接处。可以用烧红的针头在管底开一个洞，让蔗糖溶液流掉，只收集膜的部分。
8、用管底开口的方法分开收集不同的膜组分。
9、将收集的膜放在60Ti的管中，加入至少两倍体积的超纯水稀释蔗糖浓度低于20%。
10、47000rpm离心 1小时
11、用注射器重悬大约1ml的样品。
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