T细胞培养方法进展及方法学对比

T淋巴细胞的分离方法是免疫学研究的重要技术。稳定而高效地分离出高纯度且活性不受影响的T淋巴细胞是进行一系列兔疫学研究的前提与基础。现分别就如今已用的丿L种T淋巴细抱分离技术进行阐述，并着重描述每种分离方法是否改变了T细胞的生物活性及对后续试验的影响。

细胞分离技术在免疫学研究中应用非常广泛，而T淋巴细胞是介导机体特异性免疫应答的芏要成员。对T淋巴细胞表型持征及其功能的深人研究，在基础理论与临床实践中均有

熏大意义，一直是免疫学研究的热点和前沿·在过去几十年里，各种T淋巴细胞的分离技术均有不同的发展步，有亲和板结合分离法上花结形成分离法、补体介坤的细胞毒分离法、

尼龙橇分离法、磁珠分离法和流式细胞术分离法等方法，现就这几种技术的研究进展作一綜述．

1.亲和板结合分离法

亲和板结和分离法可分为直接法和同接法。直接法用特异性抗体包被塑料平皿或培养板，表达特定膜抗原的细饱即与相应抗体结合而被吸附于平皿或培养板表面·悬液中为不表达

特定膜抗原的细胞·改变缓冲液的离子强度·将结合在板上的细胞解离·获得目的细抱。这种方法首先是由Wysocki等报道的．这种方法要求抗体纯度较高，以减少非特异性细胞的结合·

且抗体与亲和板有高亲和力，这样抗体才能牢固地结合在板上以定地分离目的细胞。因此·并不是所有的抗体都适合使用亲和板结合分离法。

间接法是用第二抗体包被平厭．将预先与特异性单抗结合的淋巴细胞与之反应后，可吸附于平皿上·从而达到分离的目的。这样既解决了目标细胞一抗不能牢固结合在亲和板上的问题，又达到将目标细胞分离出来的目的。亲和板结合分离法具有简短、经济，并可以同时进行细胞的阳性分选和阴性分选．且收获量大等优点·因此．该方法适合阴性分选，以除去细胞悬液内某一细胞亚群·由于吸附于亲和板上的细胞在分离时可能会被轻微地掼伤，并且抗原抗体结合后可导致相应细胞被活化，从而限制了这种方法的广泛使用这种方法在外90年代应用较多，现在已少用。

2.E花结形成分离法

早在1982年就有学者研究表明·无论是使用溴化二氨基异硫氢化物（AET）处理还是神经氨酸酶处理的绵羊红细胞分离T细胞，都会影分选出来的T细的功能活性；同时用AET处理的绵羊红细分离T细胞和用尼龙棉分离的T细胞作功能活性上的比较．结果表明两种分选细胞方法优劣无差异性。有学者却认为经过绵羊红细胞分离的外周血淋巴细胞的功能活性增强了。Nouanthong等进一步用此类方法建立了一种计数CD4阳性淋巴细胞的方法，发现采用该方法计数的准确率与流式细胞技术相比没有明显差异。由于E花结形成主要取决于细胞间受体配基的二维亲和力和密度，Long等在此基础上建立了一个概率模型．通过这个模型半定量地判定受体与配体间的亲和力大小，从而可以作为评估人体内免疫状态的参考。

如今，E花结技术在实验室中多用作检测分析细胞的免疫水平和动态的变化·

3.补体介导的细胞毒分离法

1987年，Clouse等发表了一篇关于用补体介导的细胞分离法即用l.ympho-kwik试剂分选T细胞的报道，同时使用尼龙棉分离技术、E花结形成分离法和用l.ympho-kwtk分选试剂3种方法分别分选T细胞，结果表明用补体介导的细胞分离法分选细胞更快、更有效，并且对细胞的功能影响最小·

Lymph俨kW1k试剂是一种类似鸡尾酒的混合试剂，含有单克隆抗体和补体，在与将要分选的细胞混合后，能形成密度梯度通过抗体．抗原复合物活化补体去除B细胞和单核细胞达到分离T细胞的目的·由于不直接作用于T细胞上，对细饱的功能影响相对较小，可以很好地进行后续试验，之后的午多学者使用这种方法阴性分离T细胞。如Stel等。用补体介导的细胞分离法分选出T细胞，加双特异性抗体BIS20×3(bi-specific

antibody activating and retargeting T-cells to CD20-positive B-cells）培养．诱导T细胞的增殖活化．检细胞因子的变化，来阐述BIS20×3在介导T细胞和B细胞活化的作用机制。但是这种鸡尾酒式的分选方法是建立在抗原抗体结合的基础上，它会激活和杀伤被抗体结合的细胞，因此这种分选方法如今是作为阴选分离法，去除非目的细胞。

4.尼龙棉分离法

在1975年就有学者发现经过尼龙棉法分离的T细胞用刀豆球蛋白（concanavalin A，ConA)刺激没有反应，Manes等认为这是因为T细胞膜表面的活化控件在经过尼龙棉后被改变了最近Wohler等报了尼龙棉分选方法能改变T细胞表面的活化分子表达，改变T细胞的增殖活性和分泌细胞因子的种类，他们建汶研究者在使用尼龙棉分离法时要慎重．因为经过尼龙棉分选的T细胞膜成分可能改变，细胞的性质也随之变化。但是Delirezh等却认为经尼龙棉分选后的T细抱功能性重不会受到影响．他们用尼龙棉分离乳腺癌患者外周血T细胞，经凋亡乳腺癌细胞负载的树突状细胞刺激分选出的T细，观察T细胞增殖及分泌的细胞因子变化，来阐述在体外经凋亡乳腺癌细胞负载的树突状细胞刺激诱导的T细胞对乳腺癌的反应情况·

由于尼龙棉法分离T细胞的纯度不高，并且尼龙棉柱上可能会选择性滞留某些T细胞亚群，使回收率降低；并在操作时要时刻注意柱的流速和流量，不便控制。因此，现今常将尼

龙棉分选法作为对细胞悬液初步纯化的一种辅助手段，即在分选T细胞前用尼龙棉去除B细胞。

5.磁珠分离法

磁珠分离法的分选策略有阳性分选策略．阴性分选策略和复合分选策略·

有许多研究者认为用磁珠阳性分选不影响细胞的功能，能很好地做后续试验。Gassmann等采用磁珠阳性分选出CD4+T细胞，经过培养刺激，来阐述釉基质对初始CD4T辅助细胞迁移和CD25T细胞活化、凋亡的影响·LeDieu等认为阴性分选虽然产量和纯度较阳性分选低．但是阳性分选出来的细胞表面受体被抗体交联，可能会改变细袍的功能状态，因此，他们提出如做细胞功能研究实验，建议使用磁珠阴性分选细胞的力法。但是也有学者认为，由于阴选方法除去的细胞只能是有明确抗体结合的细胞，而没有被抗体结合不明细胞亚群依然会流出磁场，与需要的目的细胞混在一起，这就增加了

实验结果的非特异性影响。所以有学者提出，阴性分选力法适合于如果目的细胞是一群未知的群体，可用阴分选方法去除已知的非目的细胞，剩下末受影响的目的群体做研究实验。假如细胞表面的标志比较弱可用复合分选的方法，如CD4+、CD25*T细Wichlan等先用CD4+T细胞阴选试剂盒分离外周血淋巴细胞，再用CD25+的阳性分离法分选出CD4+、

CD25+T细胞，他们认为用磁珠分离法能快速大量地分选需要的细胞，对细胞用于临床治疗，提供方法学上的帮助。现已有学者将用磁珠分选出来的CD4+、CD25+T细胞回输人体或者动物体内用于治疗移物抗宿主病。

由于磁珠分选方法使用的仪器小巧，消毒方便，不需要专人操作，实验流程对细胞损伤小，有极好的回收率和存活率，因此·正普遍被人接受作为分选细胞的有效方法。

6.流式细胞术分离法

1996年出现了新型的四聚体（tetramer）技术。四聚体技术能定量抗原特异性T细胞，通过置换四体复合物中的肽，可以检测不同表位的T细胞。但是合成稔定的MHC类分子的技术很困难，还要选择一个很合适的抗原结合表位以提高与T细胞抗原受体的亲和力，并且有研究表明这种技术检测的细胞不一定都有活性，有些可能为前体细胞，有些可能己经凋亡或者是在刺激下也不能分化的惰性细胞。Lee等利用流式细胞仪快速有效地分选出肿瘤特异性CD4+、CD8+T细胞株。经测定，这种分离方法并不改变肿瘤特异性T细胞功能和表型。此方法是通过细胞亚群的不同增殖能力去分选细胞，而四聚体技术则是由于细胞表面的特异性标志不同而辨别

细胞亚群。Tung等指比室温等外界条件对流式细胞仪测定的结果有影响，流式细胞术分离T细胞的效率与仪器的操作者处理数据的能力相关。流式细胞仪及其抗体都较昂贵，有些实验室的仪器条件也不允许，则限制了其在一般实验室的广泛应用。

7.其他

此外．李付广等报道了细胞培养淘汰筛选法，该法是利用细胞在特定的培养基中死亡的时间不同而筛选纯化出T细胞，但纯度小高，目前应用很少。

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