赵钰岚等:人源血管紧张素转化酶-C结构域在毕赤酵母中的表达667

2结果与分析

2.1pPIC9K-ACE-C载体的构建与鉴定

重组质粒抽提，用Primer1/Primer2引物进行PCR鉴定，得到约2 kb的片段(图1)，与目的基因大小 (1 915 bp) 相符，用限制性内切酶Eco RⅠ和NotⅠ进行双酶切，出现约9 kb和2 kb片段，与载体 (9.3 kb) 和目的基因 (1 915 bp) 条带大小相符，说明表达载体构建成功。重组质粒的测序结果(测序图略) 也与NCBI的RNA库中查得的序列相符，未发生碱基突变。

2.2酵母重组子的鉴定和筛选

毕赤酵母GS115为His?菌株，不能合成组氨酸，因此只有含HIS4基因的重组质粒整合入GS115后，与宿主进行互补，才能在不含组氨酸的培养基MD板上生长。SacⅠ线性化后的重组质粒转化GS115后，产生His+ Mut+重组子，挑取单克隆用GS115基因组上5′AOX1引物和3′AOX1引物进行PCR鉴定(图2)，可见两条带，一条为目的基因约2.5 kb，另一条为AOX基因约2.2 kb，野生菌GS115扩增出一条带，为AOX基因，空载体对照扩增出一条大小约500 bp的带。为增加目的基因在酵母基因组中的拷贝数，提高表达量，对阳性重组子进行了2次电转，并用高浓度G418筛选高拷贝数转化子，最终获得能抗G418 3 mg/mL的酵母转化子。

2.3ACE-C结构域的诱导表达和鉴定

2.3.1甲醇浓度对蛋白表达量和酶活力变化的影响

本菌种为Mut+型，对甲醇的消耗能力较强。结

图1重组质粒的PCR鉴定与双酶切鉴定

Fig. 1 PCR amplication of ACE-C gene and restrication analysis of the expression vector pPIC9K-ACE-C. M: DNA marker; 1: pPIC9K-ACE-C/Eco RⅠ+NotⅠ; 2: PCR of ACE-C gene. 果如图3所示，甲醇浓度1.75％时，总蛋白量和酶活力都是最高的。

2.3.2pH条件对蛋白表达量和酶活力变化的影响

pH值降低会影响细胞的膜通透性，进而影响蛋白的分泌。结果如图4所示，不同pH值对酶活力的影响较大；酸性环境明显不利于ACE-C结构域的表达，在pH 5.5时，蛋白表达量和酶活力最高。

图2PCR鉴定毕赤酵母整合

Fig. 2 PCR analysis of recombinant strain. M: DNA marker; 1,2: the expression strain of pPIC9K; 3,4: wild strain; 5: the

expression strain of pPIC9K-ACE-C.

图3不同甲醇浓度诱导下的总蛋白和酶活力变化

Fig. 3 Yield of protein and enzyme activity in the fermentation

supernatant induced by different concentration of methanol.

图4不同pH条件下甲醇诱导的总蛋白和酶活力变化Fig. 4 Yield of protein and enzyme activity in the fermentation supernatant of different pH condition.