人关节软骨细胞的体外培养

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具体操作步骤如下：
1．无菌条件下取材（术中切除的全层软骨片），于含无血清的DMEM培养液的无菌容器中保存，低温下转移（冰盒），移入超净工作台，PBS冲洗3次。剪去非软骨组织如滑膜组织或纤维结缔组织。
2．收集全部软骨，移入50ml离心管中。用10mlPBS洗软骨组织碎块2－3遍。在离心管内再加入新鲜的0.25％的胰蛋白酶（10ml/g），37培养箱中消化30－45min（最好在搅伴状态下），以除去可能附着的成纤维细胞。加入等量的10％DMEM终止消化，吹打后去除胰蛋白酶和成纤维细胞，再各用10mlPBS清洗两遍。
3．将软骨移入培养皿，倒入PBS淹盖标本为止，用无菌刀片将软骨片切成1mm3大小的碎粒，移入第二个50ml离心管中，PBS淹盖，冲洗3次。（标本要稍多一点，至少大于300mg试验取1g左右，软骨块要尽量切碎，便于消化）
4．加入5ml的0.2％的II型胶原酶，37培养箱中消化4-6h,其中2h后每隔20min晃动离心管一次，观察软骨块基本被消化，悬液变混浊。（II型胶原酶消化4-6h见悬液变混浊，表明已有软骨细胞消化下来，可先收集，未消化完的的软骨碎粒可继续消化，0.1％的II型胶原酶过夜约18－24h）
5．120目滤器过滤收集悬液（用PBS冲洗滤器底和皿底尽可能收集所有细胞），彻底打匀成团的细胞。
6．1000r/min离心10min，弃上清液，PBS重悬3次，相同条件再离心，弃上清液去除胶原酶，收集细胞。
7．加入10％DMEM培养液1ml，吹打均匀后移入10cm培养皿中，补足培养液至10ml。（吹打后可行计数板计数及台盼兰活性检测，或以2.5x104/cm2的比例置于培养皿中。）
8．48h后首次换液去除未贴壁的细胞。
9．置于37 5％CO2培养箱内继续培养，每隔3－4d换液1次，倒置显微镜下观察拍照。
10．细胞长满近融合时用0.05%胰蛋白酶－0.02%EDTA消化2－3min，1200r/min离心5min，弃上清液，计数，按1：3或1：4传代。（推荐1：2传代）如果组织量多，可重复4－8步骤。

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