一种RGD-全氟化碳纳米乳MRI显影剂的制备方法

(1)纳米乳的制备：先将占磷酸盐缓冲液4wt％的磷脂和占磷酸盐缓冲液0.5wt％的普朗尼克F-68溶解在1ml磷酸盐缓冲液(PBS)中，然后将占磷酸盐缓冲液10wt％-20wt％的全氟溴辛烷(PFOB)加入到上述缓冲液中，并在超声仪中处理5-10分钟，再用试管振荡器振荡10-15分钟，得粗乳液；之后将制备的粗乳液用去离子水稀释20倍，再通过微孔滤膜挤制2次，得到纳米乳记为NPs；

(2)RGD-纳米乳的制备：将胆固醇-PEG2000-RGD加入到步骤(1)制备的纳米乳液中，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时得到靶向纳米乳NPs-RGD；

(3)荧光标记的RGD纳米乳的制备：向步骤(2)制备的靶向纳米乳中加入浓度为5mg/mL的荧光染料DiI，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时，得到DiI标记的RGD-纳米乳。

优选的，所述胆固醇-PEG2000-RGD的制备方法为：将胆固醇-PEG2000-Mal与RGDyc按摩尔比10:1-1:1加入1ml PBS中，室温下置于摇床上以300rpm的速度振荡20-24小时，然后用透析袋在超纯水中透析去除未反应的RGDyc分子，经冷冻干燥机冻干得到靶向分子胆固醇-PEG2000-RGD。

优选的，所述磷脂为大豆卵磷脂(Lipoid S75)。

优选的，所述磷酸盐缓冲液的浓度为5mM，pH为7.4。

优选的，所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。

优选的，所述胆固醇-PEG2000-RGD的加入量与磷脂的摩尔比为1：20。

优选的，步骤(1)中磷脂与F-68的质量比为8：1。

优选的，所述磷脂与全氟溴辛烷(PFOB)的质量比为1:2.5-1:5。

另外，本文还要求保护由所述方法制备得到的RGD-全氟化碳纳米乳MRI显影剂以及该显影剂应用于肺癌肿瘤的早期MRI诊断。

与现有技术相比，本文具有以下的明显有益效果：

(1)本文使用S75磷脂做膜材料，用胆固醇-PEG2000-RGD分子进行修饰，采用超声和振荡的方法制备纳米乳，其中F-68的添加可以使微乳结构更加稳定，材料便宜易得，制备方法简单并具有良好的生物相容性；

(2)本文制备的纳米乳同时作为129Xe MRI和19F MRI显影剂以及光学成像显影剂，是一种129Xe/19F双通道、双模态MRI显影剂；

(3)作为129Xe Hyper CEST显影剂，本文纳米乳具有超高的灵敏度高，可在皮摩尔浓度下对肺癌细胞进行MRI成像。通过129Xe MRI和19F MRI以及光学成像证明了该纳米乳对肺癌肿瘤具有较好的靶向性，该显影剂可以应用于肺癌肿瘤的早期MRI诊断。

具体实施方式

下面以具体实施例子，进一步阐述本文。下述实施例仅用于说明本文而不用于限制本文的范围。

实施例1

一种RGD-全氟化碳纳米乳MRI显影剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)纳米乳的制备：先将40mg的磷脂Lipoid S75和5mg普朗尼克F-68溶解在1mL浓度为5mM、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，然后将0.2g的全氟溴辛烷(PFOB)加入到上述缓冲液中，并在功率为170W超声仪中处理8分钟，再用试管振荡器振荡12分钟，得粗乳液；之后将制备的粗乳液用去离子水稀释20倍，再通过孔径为0.22μm的微孔滤膜挤制2次，得到纳米乳记为NPs；

(2)RGD-纳米乳的制备：将1.2mg的胆固醇-PEG2000-RGD加入到3mL步骤(1)制备的纳米乳液中，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时得到靶向纳米乳NPs-RGD；

(3)荧光标记的RGD纳米乳的制备：向3ml步骤(3)制备的靶向纳米乳中加入浓度为5mg/mL的荧光染料DiI，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时，得到DiI标记的RGD-纳米乳。

其中，所述胆固醇-PEG2000-RGD的制备方法为：将21.4mg胆固醇-PEG2000-Mal和5mg RGDyc加入1ml PBS中，室温下置于摇床上以300rpm的速度振荡20小时。然后用截留分子量为1000Da透析袋在超纯水中透析去除未反应的RGDyc分子，经冷冻干燥机冻干得到靶向分子胆固醇-PEG2000-RGD。

将本实施例1制备的NPs-RGD进行动态光散射检测，所得的动态光散射图如图1所示，平均水合粒径为195nm。

将本实施例1制备的NPs-RGD用透射电镜进行扫描，所得的透射电镜图如图2所示，图中可以看出，本实施例制备的NPs分散性好，粒径均一。表面有一层类似膜的结构，说明PFG-RGD分子修饰到纳米乳的表面。

将本实施例1制备的NPs-RGD进行紫外吸收检测，所得的紫外吸收光谱图如图3所示，在275nm处检测到RGD分子特征吸收峰，说明RGD分子成功修饰到纳米乳表面。

将本实施例1制备的NPs-RGD进行荧光发射光谱检测，从图4中可以看出较大发射波长为570nm。

将本实施例1制备的NPs-RGD进行氟谱检测，所得的氟谱如图5所示，PFOB的17个F显示出8组峰。

将本实施例1制备的NPs-RGD进行129Xe NMR谱检测，如图6所示，Xe在PFOB纳米乳中的信号在106ppm处，水溶液中的Xe信号在195ppm。

将本实施例1制备的NPs-RGD进行129Xe Hyper CEST谱检测，如图7所示，106ppm有一个较强的CEST信号，来自于Xe在PFOB纳米乳中的信号。

将本实施例1制备的NPs-RGD分别与正常细胞以及肿瘤细胞孵育之后测129Xe MRI谱图，如图8A所示，肿瘤细胞有较强的CEST信号，显示出很亮的信号。而正常细胞基本没有信号，说明了NPs-RGD对肿瘤细胞有特异性靶向作用。做19F MRI成像结果如图8B所示，肿瘤细胞有较强的19F信号，正常细胞没有信号，再次证明了NPs-RGD对肿瘤细胞的靶向性及MRI成像性质。

实施例2

一种RGD-全氟化碳纳米乳MRI显影剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)纳米乳的制备：先将40mg的磷脂Lipoid S75和5mg普朗尼克F-68溶解在1mL浓度为5mM、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，然后将0.1g的全氟溴辛烷(PFOB)加入到上述缓冲液中，并在功率为170W超声仪中处理5分钟，再用试管振荡器振荡10分钟，得粗乳液；之后将制备的粗乳液用去离子水稀释20倍，再通过孔径为0.22μm的微孔滤膜挤制2次，得到纳米乳记为NPs；

(2)RGD-纳米乳的制备：将1.2mg的胆固醇-PEG2000-RGD加入到3mL步骤(1)制备的纳米乳液中，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时得到靶向纳米乳NPs-RGD；

其中，所述胆固醇-PEG2000-RGD的制备方法为：将8.5mg胆固醇-PEG2000-Mal和2mg RGDyc加入1ml PBS中，室温下置于摇床上以300rpm的速度振荡20小时。然后用截留分子量为1000Da透析袋在超纯水中透析去除未反应的RGDyc分子，经冷冻干燥机冻干得到靶向分子胆固醇-PEG2000-RGD。

将本实施例2制备的NPs-RGD进行动态光散射检测，所得的动态光散射图如图9所示，平均水合粒径为205nm。

实施例3

一种RGD-全氟化碳纳米乳MRI显影剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)纳米乳的制备：先将40mg的磷脂Lipoid S75和5mg普朗尼克F-68溶解在1mL浓度为5mM、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，然后将0.2g的全氟溴辛烷(PFOB)加入到上述缓冲液中，并在功率为170W超声仪中处理10分钟，再用试管振荡器振荡15分钟，得粗乳液；之后将制备的粗乳液用去离子水稀释20倍，再通过孔径为0.22μm的微孔滤膜挤制2次，得到纳米乳记为NPs；

(2)RGD-纳米乳的制备：将0.8mg的胆固醇-PEG2000-RGD加入到2mL步骤(1)制备的纳米乳液中，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时得到靶向纳米乳NPs-RGD；

其中，所述胆固醇-PEG2000-RGD的制备方法为：将33mg胆固醇-PEG2000-Mal和1.4mg RGDyc加入1ml PBS中，室温下置于摇床上以300rpm的速度振荡20小时。然后用截留分子量为1000Da透析袋在超纯水中透析去除未反应的RGDyc分子，经冷冻干燥机冻干得到靶向分子胆固醇-PEG2000-RGD。

将本实施例3制备的NPs-RGD进行动态光散射检测，所得的动态光散射图如图10所示，平均水合粒径为210nm。

实施例4

一种RGD-全氟化碳纳米乳MRI显影剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)纳米乳的制备：先将80mg的磷脂Lipoid S75和10mg普朗尼克F-68溶解在1mL浓度为5mM、pH＝7.4的磷酸盐缓冲液中，然后将0.4g的全氟溴辛烷(PFOB)加入到上述缓冲液中，并在功率为170W超声仪中处理10分钟，再用试管振荡器振荡15分钟，得粗乳液；之后将制备的粗乳液用去离子水稀释20倍，再通过孔径为0.22μm的微孔滤膜挤制2次，得到纳米乳记为NPs；

(2)RGD-纳米乳的制备：将1.2mg的胆固醇-PEG2000-RGD加入到3mL步骤(1)制备的纳米乳液中，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时得到靶向纳米乳NPs-RGD；

将本实施例4制备的NPs-RGD进行动态光散射检测，所得的动态光散射图如图11所示，平均水合粒径为215nm。

上述实施例只是为了说明本文的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本文的内容并据以实施，并不能以此限制本文的保护范围。凡是根据本文内容的实质所作出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本文的保护范围内。

技术特征：

1.一种RGD-全氟化碳纳米乳MRI显影剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(2)RGD-纳米乳的制备：将胆固醇-PEG2000-RGD加入到步骤(1)制备的纳米乳液中，然后置于摇床上以300rpm的速度振荡1小时得到靶向纳米乳NPs-RGD；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述胆固醇-PEG2000-RGD的制备方法为：将胆固醇-PEG2000-Mal与RGDyc按摩尔比10:1-1:1加入1ml PBS中，于室温下置于摇床上以300rpm的速度振荡20-24小时，然后用透析袋在超纯水中透析去除未反应的RGDyc分子，经冷冻干燥机冻干得到靶向分子胆固醇-PEG2000-RGD。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磷脂为大豆卵磷脂(Lipoid S75)。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的浓度为5mM，pH为7.4。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述微孔滤膜的孔径为0.22μm。

6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述胆固醇-PEG2000-RGD的加入量与磷脂的摩尔比为1：20。

7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中磷脂与F-68的质量比为8：1。

8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述磷脂与全氟溴辛烷(PFOB)的质量比为1:2.5-1:5。

9.根据权利要求1-7任一项所述方法制备得到的RGD-全氟化碳纳米乳MRI显影剂。

BDP650/665azide活体荧光造影剂

BDP650/665azide,Borondipyrromethenedyeforfluorescein(514nm)channel-verybrightandphotostablefluorophore.

BDP650/665alkyne活体荧光造影剂

BDP650/665alkyne,Borondipyrromethenedyeforfluorescein(513nm)channel-verybrightandphotostablefluorophore.

BDP630/650XNHSester活体荧光造影剂

BDP630/650XNHSester,Borondipyrromethenedyeforfluorescein(512nm)channel-verybrightandphotostablefluorophore.

BDP630/650tetrazine活体荧光造影剂

BDP630/650tetrazine,Borondipyrromethenedyeforfluorescein(511nm)channel-verybrightandphotostablefluorophore.

BDP630/650maleimide活体荧光造影剂

BDP630/650maleimide,Borondipyrromethenedyeforfluorescein(510nm)channel-verybrightandphotostablefluorophore.

BDP630/650hydrazide活体荧光造影剂

BDP630/650hydrazide,Borondipyrromethenedyeforfluorescein(509nm)channel-verybrightandphotostablefluorophore.

BDP630/650carboxylicacid活体荧光造影剂

BDP630/650carboxylicacid,Borondipyrromethenedyeforfluorescein(508nm)channel-verybrightandphotostablefluorophore.

BDP630/650azide活体荧光造影剂

BDP630/650azide,Borondipyrromethenedyeforfluorescein(507nm)channel-verybrightandphotostablefluorophore.

BDP630/650amine活体荧光造影剂

BDP630/650amine,Borondipyrromethenedyeforfluorescein(506nm)channel-verybrightandphotostablefluorophore.

BDP630/650alkyne活体荧光造影剂

BDP630/650alkyne,Borondipyrromethenedyeforfluorescein(505nm)channel-verybrightandphotostablefluorophore.

wyf 04.07

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