qPCR实验疑难杂问解答

看了别人文献里的PCR方法，照搬了人家的引物，还是做得每次结果都不一样？不是Ct值出现过晚，就是扩增曲线变化很奇怪，总是操作过程中时不时有这样或者那样的问题，遇到这些问题怎么处理呢？实践出真知，今天给大家汇总一下qPCR常见的疑难解答，看下方详细介绍：

疑问1：Ct值出现过晚（Ct>38）

答：

扩增效率低，反应条件不够优化，降低退火温度，增加镁离子浓度。
反应成分降解或加样量不足
PCR产物过长，一般采用80-150bp.

疑问2：标准曲线线性关系不佳

答：

加样存在误差，是样品浓度不成梯度。
标准品出现降解，避免反复冻融。
引物或者探针设计不佳。
模板中存在抑制物或模板浓度过高。

疑问3：溶解曲线存在多个主峰

答：

引物设计不够优化。
引物浓度不佳，上下游引物浓度比例不一致。
镁离子浓度过高。
模板基因组的污染。

疑问4：同一样品中，其中某一个荧光信号特别强。

答:

试剂配制时反应液没有完全溶化，导致探针量在一管增多。
试剂配制时没有充分混匀致各管中各成分的量不同。
PCR仪热槽被荧光物质污染，需要清除热槽中的污染。

疑问5：扩增曲线有一向上或向下的尖峰？

答：

反应过程中电压不稳定
可能在20个循环左右时，仪器有停下或仪器有开盖，使光线突然增强
如果尖峰向下，可能是由卤素灯老化所致，这时应更换。

疑问6：部分样本扩增效率过低？

答:

提取液残留，一定程度抑制了PCR反应
反应液未严格取量混匀或分装不均匀
试剂失效

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