CUL5-SOCS6 complex regulates mTORC2 function by targeting Sin1 for degradation

雷帕霉素(mTOR) 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，通过形成两个结构相似的复合物（mTORC1 和 mTORC2）磷酸化不同的底物。 mTORC2 由 Sin1、Rictor、GβL 和 mTOR 组成，主要通过磷酸化 AKT 的疏水基序（AKT1 的 Ser473 位点）和可能的其他 AGC 激酶家族成员来调节细胞存活和增殖。作为细胞信号网络的中心调节剂，mTORC2 活性受到各种调节。例如，Sin1 的 T86 和 T398 磷酸化会损害 mTORC2 复合物的完整性并抑制 AKT 激活，而 PtdIns (3,4,5) P3 与 Sin1 的 PH 结构域相互作用并导致 mTORC2 复合物的激活。因此，Sin1 是调节生理信号与正常 mTORC2 功能之间的串扰的关键成分。尽管 mTOR 和 Rictor 已被证明受泛素 E3 连接酶的调节，但尚未研究 Sin1 或 mTORC2 活性的蛋白质降解依赖性调节。
泛素-蛋白酶体系统 (UPS) 是通过将泛素分子与蛋白质底物结合作为蛋白酶体降解的信号来控制蛋白质周转的主要系统。 Cullin-RING 泛素蛋白连接酶 (CRL) 是最大的泛素 E3 连接酶家族，典型的 CRL 包括作为支架的 Cullin 蛋白 (CUL)、底物识别亚基和具有内在 E3 的环蛋白 (RBX1 或 RBX2)活动）。迄今为止，研究得最好的 Cullin 家族成员是 Cullin1，它形成 CRL1（也称为 SCF 复合物）来控制许多关键癌蛋白或肿瘤抑制因子（包括 c-Myc、β-Catenin 和 p27）的转换。另一方面，Cullin5 (CUL5) 主要与细胞因子信号抑制蛋白 (SOCS) 盒蛋白、环指蛋白 RBX2 和衔接蛋白复合物-ElonginB/C 结合，形成功能性 CRL5 E3 连接酶。尽管已鉴定出 40 多种 SOCS 盒蛋白，但鉴定出的底物相对较少，并且 CRL5 的功能作用在很大程度上是未知的。

我们最初发现蛋白酶体抑制剂 MG132 和 NEDD8 激活酶抑制剂 MLN4924 处理均增加了 293T 细胞中的 Sin1 蛋白水平，表明 Sin1 蛋白可能受 CRL 家族 E3 连接酶控制（补充图 1a）。
有趣的是，RBX2 而非 RBX1 的消耗显着增加了 Sin1 的表达（图 1a）。由于 RBX2 与 CUL5 唯一相关，而其他 Cullin 家族成员与 RBX1 相互作用，我们假设 CRL5 复合物可能是调节 Sin1 降解的主要 E3 连接酶。实际上，在转染/共免疫沉淀（IP）实验中，Sin1 与 CUL5 而不是 CUL2 特异性相互作用（补充图 1b）。重要的是，CUL5、RBX2 和 ElonginB/C（CRL5 复合物中的衔接蛋白）的消耗，而不是其他 Cullin 蛋白的消耗，都导致 Sin1 的上调（图 1b 和补充图 1c）。
为了鉴定特异性介导 CRL5 依赖性 Sin1 调节的 SOCS 盒蛋白，我们进行了基于 shRNA 的筛选（数据未显示）和 Co-IP 实验，并观察到 Sin1 和 SOCS6 之间的相互作用，但没有检查其他 SOCS 盒蛋白(补充图 1d). 并且通过 Co-IP 实验在内源水平进一步验证了 Sin1-SOCS6 的相互作用 (图 1c). 为了支持 SOCS6 在调节 Sin1 稳定性中的作用, 异位表达的 SOCS6 促进了 Sin1 泛素化并缩短了 Sin1放线菌酮追踪实验中的半衰期，而内源性 SOCS6 的消耗降低了 Sin1 泛素化（图 1d 和补充图 1e-g）。
通过产生各种 Sin1 截断，我们发现 N 末端区域（1-136 个氨基酸）的Sin1 负责 SOCS6 相互作用和 SOCS6 依赖性多泛素化（补充图 2a-c）。基于PhosphoSitePlus（https://www.phosphosite.org/）报道的可能的Sin1泛素化位点，我们进一步构建了各种Sin1突变体，发现4个赖氨酸位点（K162、K166、K276、K302）可能是主要的泛素化位点Sin1 的突变，因为它们的突变减少了 Sin1 泛素化（补充图 2d）。此外，在这 4 个已确定的主要泛素化位点中，K162、K276 和 K302 可能介导 SOCS6 依赖性泛素化和 Sin1 的降解，因为它们的突变有效地阻断了异位 SOCS6 介导的 Sin1 下调（补充图 2e）。接下来，我们继续研究 SOCS6 是否通过控制 Sin1 表达来调节 mTORC2 活性。尽管 SOCS6 不能与 mTOR 竞争 Sin1 相互作用（补充图 2f），但 SOCS6 在 HEK293T 细胞中的异位表达降低了内源性 Sin1 和 pS473-AKT1 信号（代表 mTORC2 活性）的表达，这可以通过添加蛋白酶体抑制剂来逆转MLN2238（补充图 3a）。
由于 SOCS6 基因在胰腺癌中被报道下调，我们利用胰腺癌细胞系 PANC1 和 BXPC3 来检查 SOCS6 对 mTORC2-AKT 通路的潜在影响。 SOCS6 在 PANC1 细胞中的异位表达降低了内源性 pS473-AKT1 信号而不影响 AKT1 蛋白丰度，并降低了顺铂处理后的细胞存活率（补充图 3b，c）。用 CRISPR/Cas9 方法在 PANC1 和 BXPC3 细胞中敲除 SOCS6 基因导致 Sin1 蛋白积累，增加 pS473-AKT1 信号，减少伴侣介导的自噬（通过改变溶酶体 HSC70 水平来证明），但对 mTOR 的影响很小（图 1e 和补充图 3d）。重要的是，sgSOCS6 细胞中 AKT1 的激活被 shRNA 介导的 Sin1 消耗有效逆转（图 1e 和补充图 3d），进一步支持 SOCS6 是 mTORC2-AKT 通路的主要调节因子。值得注意的是，与 pS473-AKT1 信号不同，PI3K-PDK1 通路介导的 AKT1 Thr308 磷酸化不受 SOCS6 敲除或 Sin1 敲除的影响，这表明 SOCS6 对 mTORC2 活性的高度特异性调节（图 1e 和补充图 3d）.
AKT的激活对于细胞通过各种机制抵抗凋亡信号很重要，因此AKT信号升高与癌细胞的耐药性有关。为了检查 SOCS6 依赖性 Sin1 调节是否在细胞存活和耐药性中发挥作用，我们用顺铂和吉西他滨处理了上述产生的 PANC1 和 BXPC3 细胞，并通过 CCK8 实验确定了细胞存活率。如图所示，SOCS6 的消耗显着增加了药物治疗后的细胞存活率，这被 Sin1 或 AKT 抑制剂治疗的敲低所逆转（图 1f 和补充图 3e、f）。总的来说，这些数据表明 SOCS6 可能通过 mTORC2-AKT 轴调节细胞存活的关键功能。
AKT 与通过调节不同底物（包括 Skp2）促进细胞增殖有关，Skp2 是通过降解 p21、P27 和许多其他物质来调节细胞周期的主要调节剂。因此，我们继续研究 SOCS6 的消耗是否对细胞增殖特征有任何影响。实际上，sgSOCS6 处理的 PANC1 细胞比对照细胞增殖得快得多，并且在锚定依赖性条件下形成更多的集落（图 1g 和补充图 3g）。
为了评估 SOCS6 在调节肿瘤发生中的功能影响，将 SOCS6 耗尽或载体处理的 PANC1 细胞皮下植入裸鼠体内进行异种移植肿瘤发生测定。接种后20天，两组肿瘤均生长，每3天测量一次肿瘤大小。引人注目的是，移植SOCS6耗尽的PANC1细胞的小鼠比注射对照PANC1细胞的小鼠发展出更大的肿瘤（图1h和补充图3h，i）。此外，源自 sgSOCS6 处理的 PANC1 细胞的肿瘤具有比对照组更高的 pS473-AKT1 信号，进一步支持 SOCS6 在抑制 mTORC2-AKT 途径中的作用（图 1i，j）。与 SOCS6 推定的肿瘤抑制功能一致，我们发现在 COSMIC 体细胞数据库中报告的两个自然发生的 SOCS6 突变(K17N和E61Q)位于其 N 端 Sin1 相互作用区域内，这减少了 SOCS6-Sin1 相互作用并损害了 SOCS6 介导的 Sin1 降解（补充图 4a-d）。总之，我们的研究结果确定了 CUL5-SOCS6 E3 复合物通过 Sin1 稳定性控制对 mTORC2 通路的新调节，这可能为理解涉及癌细胞存活和耐药性的动态信号级联反应提供新的思路。

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