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MISO是一款经典的可变剪切分析工具，和rmats类似，该软件也支持对可变剪切事件进行定量和差异分析，网址如下

https://miso.readthedocs.io/en/fastmiso/index.html#

这个软件支持exon和transcript两种水平的可变剪切分析，在rmats的文章中，我们也提到了rmats是从exon水平给出的可变剪切结果，因为二代测序读长短的特点，无法有效得到转录本全长，从exon水平得到的结果更加的准确，而且阳性结果更容易通过RT-PCR验证出来，但是无法详细的探究某个基因不同isoform之间的变化；transcript水平直接给出不同isoform间的定量和差异，能有效的探究基因不同isofrm的变化情况，但是结果准确性较差。

该软件是一个python包，直接通过pip就可以安装，分析的pipeline如下

1. 对参考基因组的GFF文件建索引

对于transcript水平的分析而言，只需要提供转录本的GFF文件，可以从Ensembl等数据库下载参考基因组的gtf文件，然后自己转换成GFF3格式；对于exon水平而言，需要提供已知的可变剪切事件的GFF格式文件，示意如下

chr1  SE      gene    4772649 4775821 .       -       .       ID=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-;Name=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-
chr1  SE      mRNA    4772649 4775821 .       -       .       ID=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.A;Parent=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-
chr1  SE      mRNA    4772649 4775821 .       -       .       ID=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.B;Parent=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-
chr1  SE      exon    4775654 4775821 .       -       .       ID=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.A.up;Parent=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.A
chr1  SE      exon    4774032 4774186 .       -       .       ID=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.A.se;Parent=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.A
chr1  SE      exon    4772649 4772814 .       -       .       ID=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.A.dn;Parent=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.A
chr1  SE      exon    4775654 4775821 .       -       .       ID=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.B.up;Parent=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.B
chr1  SE      exon    4772649 4772814 .       -       .       ID=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.B.dn;Parent=chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:-@chr1:4772649:4772814:-.B

第二列表示可变剪切的类型，以外显子跳跃为例，ID的格式如下

chr1:4775654:4775821:-@chr1:4774032:4774186:@chr1:4772649:4772814

包含了用@符号隔开的3个外显子，中间的exon的跳过的外显子，第一个为上游的外显子，第二个为下游的外显子，对应如下示意图中的3个exon

transcript水平的GFF文件从数据库中下载即可，而exon水平的GFF文件是需要自己先识别可变剪切的不同isoform,然后整理得到的，对于人和小鼠等常见物种，官网提供了exon水平的GFF文件，链接如下

https://miso.readthedocs.io/en/fastmiso/annotation.html

准备好GFF文件之后，就可以建立索引了，命令如下

index_gff --index ensGene.gff3 index_db

index_db为索引保存的目录。

2. 运行miso

运行miso需要第一步建好的索引以及样本对应的bam文件，该bam文件必须是经过排序处理的，而且有对应的bai索引，对于双端数据，用法如下

miso --run
index_db \
algin.sorted.bam \
--output-dir out_dir \
--read-len 150 \
--paired-end 250 15 \
--settings-filename miso_settings.txt

read-len是reads的平均长度，paired-end代表插入片段长度的平均值和方差，miso_settings.txt是配置文件，内容如下

[data]
filter_results = True
min_event_reads = 20
strand = fr-unstranded
[sampler]
burn_in = 500
lag = 10
num_iters = 5000
num_processors = 4

配置文件中的参数很多，就不一一解释了，每个参数的意义请参考官方文档。
通过上述方式得到的结果可以直接用于后续的差异分析，但是这个结果不利于我们查看，所以官方提供了汇总程序，用法如下

summarize_miso \
--summarize-samples \
raw_out/ \
summary_out1

3. 样本间的差异分析

进行样本间差异分析的代码如下

compare_miso --compare-samples control case/ comparisons/

在输出目录，会生成一个后缀为bf的文件。

4. 对结果进行过滤

用法如下

filter_events \
--filter  case_vs_control.miso_bf \
--num-inc 1 \
--num-exc 1 \
--num-sum-inc-exc 10 \
--delta-psi 0.20 \
--bayes-factor 10 \
--output-dir filter_dir

5. 可视化

用法如下

sashimi_plot \
--plot-event "chr1:7778:7924:-@chr1:7096:7605:-@chr1:6717:6918:-" \
index_db/ \
sashimi_plot_settings.txt  \
--output-dir out_dir

sashimi_plot_settings.txt是配置文件，其中设置了样本的bam文件和可变剪切的输出结果，示例如下

[data]
# directory where BAM files are
bam_prefix = ./test-data/bam-data/
# directory where MISO output is
miso_prefix = ./test-data/miso-data/bam_files = ["heartWT1.sorted.bam","heartWT2.sorted.bam","heartKOa.sorted.bam","heartKOb.sorted.bam"]miso_files = ["heartWT1","heartWT2","heartKOa","heartKOb"][plotting]
# Dimensions of figure to be plotted (in inches)
fig_width = 7
fig_height = 5
# Factor to scale down introns and exons by
intron_scale = 30
exon_scale = 4
# Whether to use a log scale or not when plotting
logged = False
font_size = 6# Max y-axis
ymax = 150# Whether to plot posterior distributions inferred by MISO
show_posteriors = True# Whether to show posterior distributions as bar summaries
bar_posteriors = False# Whether to plot the number of reads in each junction
number_junctions = Trueresolution = .5
posterior_bins = 40
gene_posterior_ratio = 5# List of colors for read denisites of each sample
colors = ["#CC0011","#CC0011","#FF8800","#FF8800"]# Number of mapped reads in each sample
# (Used to normalize the read density for RPKM calculation)
coverages = [6830944,14039751,4449737,6720151]# Bar color for Bayes factor distribution
# plots (--plot-bf-dist)
# Paint them blue
bar_color = "b"# Bayes factors thresholds to use for --plot-bf-dist
bf_thresholds = [0, 1, 2, 5, 10, 20]

最终会产生如下所示的结果

这种图称之为sashimi plot , 是一种专用于可变剪切可视化的图表，上述示意图表示的是一个外显子跳跃事件在不同样本中的表达情况，左下方是GFF文件中共的exon结构，左上方是每个样本中比对上exon的reads的可视化，采用了RPKM表示，不同剪切方式用曲线链接，曲线上标记的是比对上该区域的reads数目，不同分组的样本用不同颜色表示，右侧的图片是样本中对应的可变剪切的表达量值。

从这种图中，可以直观的看到两组样本间的可变剪切表达有无差异，上图中heartWT组中的表达量高于heartKO组。

实际分析时，由于需要手动整理可变剪切isofrom对应的gff文件，所以使用的难度较大，但是其提供的可视化功能是非常值得借鉴的。

·end·

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