目前用于Pacbio HIFI测序数据的组装软件主流上有：FALCON、Hifiasm、Hicanu、NextDenovo。

Hifiasm的使用

介绍

Hifiasm是用于PacBio Hifi读取的快速单倍型解析的从头汇编程序。它可以在几个小时内组装一个人类基因组，并与加利福尼亚红木基因组（迄今为止测序最复杂的基因组之一）一起工作。Hifiasm可以生产质量最好的组装商的初级/替代组装。它还引入了新的图合并算法，并在给定三重数据的情况下实现了最佳的单倍型解析程序集。

我认为hifiasm不仅组装速度快，而且准确度也很好，所以还是很推荐使用

软件安装

#使用conda安装
conda install -c bioconda hifiasm#安装hifiasm（需要g++和zlib）
git clone https://github.com/chhylp123/hifiasm
cd hifiasm && make

格式转换

由于是bam格式需要转换为fasta格式

# bam --> fasta
samtools view *.bam | awk '{print ">"$1"\n"$10}' > fasta#补充一下其他格式的转换
## sam ---> fasta
cat *.sam | awk '{print ">"$1"\n"$10}' > *.fasta
## fasta ---> sam
bowtie2 -1 *_1.fa -2 *_2.fa -p 16 -x prefix -S *.sam
## sam --> bam
# -@：线程 -b：输出格式为BAM -S：自动检测输入格式 -o：输出文件
samtools view -@ 16 -b -S final.sam -o final.bam
## bam --> sam
samtools view *.bam -O SAM > *.sam

软件参数

$ hifiasm
Usage: hifiasm [options] <in_1.fq> <in_2.fq> <...>
Options:Input/Output:-o STR       prefix of output files [hifiasm.asm]-i           ignore saved read correction and overlaps-t INT       number of threads [1]-z INT       length of adapters that should be removed [0]--version    show version numberOverlap/Error correction:-k INT       k-mer length (must be <64) [51]-w INT       minimizer window size [51]-f INT       number of bits for bloom filter; 0 to disable [37]-D FLOAT     drop k-mers occurring >FLOAT*coverage times [5.0]-N INT       consider up to max(-D*coverage,-N) overlaps for each oriented read [100]-r INT       round of correction [3]Assembly:-a INT       round of assembly cleaning [4]-m INT       pop bubbles of <INT in size in contig graphs [10000000]-p INT       pop bubbles of <INT in size in unitig graphs [0]-n INT       remove tip unitigs composed of <=INT reads [3]-x FLOAT     max overlap drop ratio [0.8]-y FLOAT     min overlap drop ratio [0.2]-u           disable post join contigs step which may improve N50--lowQ       INToutput contig regions with >=INT% inconsistency in BED format; 0 to disable [70]--b-cov      INTbreak contigs at positions with <INT-fold coverage; work with '--m-rate'; 0 to disable [0]--h-cov      INTbreak contigs at positions with >INT-fold coverage; work with '--m-rate'; -1 to disable [-1]--m-rate     FLOATbreak contigs at positions with <=FLOAT*coverage exact overlaps;only work with '--b-cov' or '--h-cov'[0.75]--primary    output a primary assembly and an alternate assemblyTrio-partition:-1 FILE      hap1/paternal k-mer dump generated by "yak count" []-2 FILE      hap2/maternal k-mer dump generated by "yak count" []-c INT       lower bound of the binned k-mer's frequency [2]-d INT       upper bound of the binned k-mer's frequency [5]-3 FILE      list of hap1/paternal read names []-4 FILE      list of hap2/maternal read names []--t-occ      INTforce remove unitigs with >INT unexpected haplotype-specific reads;ignore graph topology; [60]Purge-dups:-l INT       purge level. 0: no purging; 1: light; 2/3: aggressive [0 for trio; 3 for unzip]-s FLOAT     similarity threshold for duplicate haplotigs [0.75 for -l1/-l2, 0.55 for -l3]-O INT       min number of overlapped reads for duplicate haplotigs [1]--purge-cov  INTcoverage upper bound of Purge-dups [auto]--n-hap      INTnumber of haplotypes [2]Hi-C-partition:--h1 FILEs   file names of Hi-C R1  [r1_1.fq,r1_2.fq,...]--h2 FILEs   file names of Hi-C R2  [r2_1.fq,r2_2.fq,...]--seed INT   RNG seed [11]--n-weight   INTrounds of reweighting Hi-C links [3]--n-perturb  INTrounds of perturbation [10000]--f-perturb  FLOATfraction to flip for perturbation [0.1]

用法

典型的hifiasm命令行如下所示：

hifiasm -o <outputPrefix> -t <nThreads> <HiFi-reads.fasta>
#eg：
hifiasm -o NA12878.asm -t 32 NA12878.fq.gz

其中NA12878.fq.gz提供输入reads，-t设置使用中的CPU数,-o输出文件的前缀名

加入HiC测序数据进行hifiasm组装：
在新版本中可添加hic测序数据进行组装，组装的结果还是不错的

hifiasm --h1 HIC_1_clean.fq.gz --h2 HIC_2_clean.fq.gz -t 50 HiFi-reads.fq.gz# --h1 --h2 HiC 数据
# -t 线程数
# -o 输出文件前缀
# HiFi-reads.fq.gz

当亲本reads可用时，hifiasm可以生成一对具有三位一体的单倍型解析程序集。要进行这种组装，需要先用yak计算k-mers，然后进行组装：

yak count -b37 -t <nThreads> -o <pat.yak> <paternal-short-reads.fastq>
yak count -b37 -t <nThreads> -o <mat.yak> <maternal-short-reads.fastq>#eg：
yak count -k31 -b37 -t16 -o pat.yak paternal.fq.gz
yak count -k31 -b37 -t16 -o mat.yak maternal.fq.gz

然后我们用以下命令产生the paternal assembly and the maternal assembly：

hifiasm -o <outputPrefix> -t <nThreads> -1 <pat.yak> -2 <mat.yak> <HiFi-reads.fasta>
#eg:
hifiasm -o NA12878.asm -t 20 -1 pat.yak -2 mat.yak NA12878.fq.gz

结果

对于非三重组装，hifiasm会生成以下文件：

prefix.r_utg.gfa(Haplotype-resolved raw unitig graph in GFA format)：保留了组装生成的所有单体型信息，包括体细胞突变和重复的测序错误。
prefix.p_utg.gfa(Haplotype-resolved processed unitig graph without small bubbles)：无小气泡的单倍型解析；去掉由于体细胞突变和数据背景噪音引起的small bubbles（这个并不是真正的单体型信息），对于高度杂合基因组物种优先选择这个结果。
prefix.p_ctg.gfa(Primary assembly contig graph)：对于低杂合度物种来说，优先选择该文件；对于高杂合度物种，该结果代表其中一个单倍型。
prefix.a_ctg.gfa(Alternate assembly contig graph)：组装出来的另一套单体型基因组结果。

对于三重组装，hifiasm会生成以下文件：

prefix.r_utg.gfa(Haplotype-resolved raw unitig graph in GFA format):保存了所有的单倍型信息。
prefix.hap1.p_ctg.gfa(Phased paternal/haplotype1 contig graph):保留了阶段性父系/单倍型1组装。
prefix.hap2.p_ctg.gfa(Phased maternal/haplotype2 contig graph):保留了阶段性母系/单倍型2组装。

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