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导读

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径普遍存在于真核生物中。MAPK在激活后会磷酸化不同的底物蛋白，诱导生物体对外源或内源刺激做出应答反应，从而在生长发育以及抗逆过程中发挥重要作用。目前关于单个MAPK的功能，已经在植物病原真菌中被广泛报道，但是对植物病原真菌不同MAPK通路之间的交叉互作机制还知之甚少。

近日，美国普渡大学/西北农林科技大学许金荣/江聪团队在Stress Biology在线发表题为“Deletion of all three MAP kinase genes results in severe defects in stress responses and pathogenesis in Fusarium graminearum” 的研究论文，在禾谷镰刀菌中通过多基因敲除，首次获得了一个不含任何MAPK的真菌菌株，并报道了该菌株在生长发育、逆境响应以及生物互作过程的缺陷，为揭示植物病原真菌MAPK的作用机制提供新的见解。

MAPK信号途径在接受胞外信号的刺激后磷酸化下游靶标蛋白(如转录因子等)以实现对基因表达的调控。禾谷镰刀菌中存在三个MAPK激酶：Mgv1、Gpmk1和FgHog1。其中，Mgv1与酵母Slt2同源，负责维持细胞壁完整性；Gpmk1与酵母Fus3/Kss1同源，与有性发育、侵染等过程密切相关；FgHog1主要介导对渗透压和氧化胁迫的响应。

虽然禾谷镰刀菌的三个MAPKs参与了不同的生物学过程，但是前期研究表明它们在侵染致病、有性生殖以及次生代谢中可能具有重叠的功能。为了更深入的了解禾谷镰刀菌乃至真菌中MAPK激酶间的功能及交叉互作关系，本文在禾谷镰刀菌中构建了MAPKs三敲突变体菌株，并对其营养生长、有性发育、非生物胁迫响应以及生物互作中的缺陷进行全面的观察与分析，并利用转录组、代谢组学手段进一步探究引起缺陷的分子基础，研究结果有助于丰富和拓展对真菌MAPK功能及作用机制的认识。

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禾谷镰刀菌MAPK三敲突变体生长滞缓、致病力丧失

与野生型相比，MAPK三敲突变体生长滞缓，但是相比Gpmk1 mgv1双敲突变体生长却有所回复(图1a)，表明Mgv1和FgHog1之间存在一定程度的拮抗作用。三敲突变体孢子形态变长，而类似表型在单敲和双敲突变体中均未发现(图1c)，表明三个MAPKs在孢子形态调控时存在功能冗余。对有性生殖进行观察，发现自交条件下突变体子囊壳无法正常形成，而杂交则表现为父本可育(图1e)。

图1. MAPKs在菌丝生长、分生孢子产生及有性生殖中的作用

作为致病真菌，野生型禾谷镰刀菌在接种其寄主小麦穗及玉米须时均呈现出病症，而三敲突变体却几乎完全丧失了致病能力(图2a-b)。扫描电镜的观察显示，三敲突变体无法形成正常的侵染结构(图2c)。除此之外，通过在小麦胚芽鞘中观察侵染菌丝形态，发现突变体侵染菌丝的分化能力降低，且不能在植物细胞间有效地穿梭及扩展(图2d)。而作为重要的致病因子，DON毒素的合成也因为MAPKs的敲除而被显著抑制(图2e)。

图2. 禾谷镰刀菌MAPK三敲突变体丧失侵染能力

02

禾谷镰刀菌MAPKs在非生物胁迫应答、与环境微生物的竞争中发挥重要作用

植物病原菌生长和侵染过程中会面临环境及植物体内各种非生物胁迫。本文观察了MAPK三敲突变体在不同胁迫下的生长状态，发现三敲突变体对细胞壁压力及氧化压力均表现出敏感性(图3a,c-e)。在渗透压力下，不仅孢子萌发、芽管伸长受限，还表现出明显的极性变化(图3b)，这与FgHog1单敲突变体有相似之处，但却更为显著。表明FgHog1在渗透压力下的极性建成中发挥了主效作用，但其他两个MAPKs也同样具有一定贡献。

Brassinin是一种植保素，能够抑制病原真菌的生长和侵染，然而关于真菌如何耐受和响应Brassinin尚不清楚。本研究发现，mgv1单敲突变体以及三敲突变体对Brassinin的处理高度敏感，表明Mgv1介导的MAPK信号通路可能是病原真菌响应Brassinin的主要途径(图3f-h)。

图3. 多种非生物胁迫条件下MAPK三敲突变体的表现

真菌在自然界中生存，需要面临与其他微生物的竞争。目前对于病原真菌MAPK在细菌-真菌和真菌-真菌相互作用中的作用还鲜有报道。本文探究了禾谷镰刀菌MAPKs在生防细菌Bacillus velezensis及重寄生真菌Clonostachys rosea互作过程中的作用。与野生型相比，三敲突变体的生长更易受到B. velezensis的抑制，显微观察显示在与B. velezensis共培养时，三敲突变体的芽管产生了大量膨大结构，影响了菌丝的生长(图4a-d)。在与C. rosea对峙培养时，三敲突变体更容易被寄生成功(图4e)。综上，MAPKs的缺失降低了禾谷镰刀菌与其他微生物的竞争力。

图4. MAPK的缺失降低了禾谷镰刀菌与其他微生物互作中的竞争力

03

MAPKs调控了基因表达和次生代谢过程

为了探明引起MAPK三敲突变体表型缺陷的机制，本文对野生型和三敲突变体进行了RNA-seq测序，共鉴定出1469 个上调表达基因和 2203个下调表达基因。有趣的是这些差异表达基因大多位于与兼性染色质相关的快速进化亚基因组区，且差异表达基因中存在大量ABC／MFS家族转运蛋白(图５a-b)。值得注意的是，腺苷酸环化酶基因FAC1在三敲突变体中上调表达，与此对应的是突变体胞内cAMP含量升高(图5c)。这表明三个MAPKs缺失导致了cAMP-PKA信号通路的过激活，一定程度上替代了MAPK通路的信号传导功能，这也可能是细胞缺失所有MAPK信号途径依然可以存活的重要原因。

另外，为了探究MAPKs的缺失对真菌次生代谢的影响，本文对野生型和三敲突变体进行了代谢组学分析，发现花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸类化合物在突变体中显著下调(图5e)，其中亚油酸和α-亚麻酸被报道具有抗细菌和抗真菌活性，这可能是三敲突变体在真菌-细菌和真菌-真菌相互作用中竞争力降低的原因之一。

图5. MAPK三敲突变体的转录组和代谢组分析

展  望

总的来说，在禾谷镰刀菌的多项生命过程中，不论是生长发育、侵染致病、非生物胁迫响应、还是与其他微生物竞争，MAPKs都发挥了不可或缺的作用。不同MAPK通路以单独或协同的方式构建了精密而复杂的信号调控网络。本文报道了一个MAPK全敲除的真菌菌株在生长发育、逆境响应以及生物互作过程的缺陷，为揭示植物病原真菌MAPKs的作用机制提供新的思路和材料。后续对于不同MAPKs、不同信号通路间的关联研究将进一步丰富对真菌信号调控网络的认识。

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链接：

https://link.springer.com/article/10.1007/s44154-021-00025-y

参考文献

1. Ren, J., Zhang, Y., Wang, Y. et al. Deletion of all three MAP kinase genes results in severe defects in stress responses and pathogenesis in Fusarium graminearum. Stress Biology 2, 6 (2022). https://doi.org/10.1007/s44154-021-00025-y

作者简介

本刊副主编、美国普渡大学许金荣教授和西北农林科技大学植保学院江聪教授为本文共同通讯作者。西北农林科技大学博士研究生任静毅为第一作者。

许金荣教授主要从事病原真菌分子遗传学、功能基因组学及致病机制研究。江聪教授主要从事植物病原真菌致病机制以及与寄主互作研究。西北农林科技大学刘慧泉教授和张雪助理研究员也参与了本研究。旱区作物逆境生物学国家重点实验室实验平台为文章完成提供了技术支撑。

本研究受国家自然科学基金、西北农林科技大学旱区作物与逆境生物学学科群的资助。

期刊简介

Stress Biology是由西北农林科技大学与Springer合作出版、康振生院士与朱健康院士共同担任主编的一本开放获取型线上期刊，专注于刊发逆境生物学最新研究进展与资讯，致力于打造引领科技发展前沿的国际学术交流平台。期刊汇聚来自10个国家的58位国际知名专家组成编委会，编委平均h-index约为38。

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