bigwig归一化方式详解

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在chip_seq数据展示时，经常会用到bigwig文件，导入igvtools等基因组浏览器中，产生如下所示的图片

我们将IP样本相对Input样本中reads富集的区域定义为peak, 反映到上图中，则对应的为IP样本中reads出现了峰值，比如下图红色标记的区域

通过这种可视化的方式，可以直观的反映出peak区域的情况，但是在实际使用中需要注意归一化的问题。

bigwig文件本质上展示的是测序深度的分布信息，而原始的测序深度是和测序的reads量呈正相关关系的，比如Input样本测序5G, IP样本测序10G, 在原始的测序深度看，会看到Input样本相比IP样本，其测序深度是偏高的。当然这个是一个极端的例子，但是很好的说明了测序量的差异对原始的测序深度会有直接的影响。

为了消除样本间测序数据量差异的影响，很当然的我们想到了归一化，类似转录组中的定量策略，原始的测序深度就是raw count, 那么当然类似RPKM, CPM等归一化方式，对于bigwig文件而言，同样适用。

在deeptools中，提供了多种归一化方式

1. RPKM

RPKM的公式如下

RPKM (per bin) = number of reads per bin / (number of mapped reads (in millions) * bin length (kb))

用法如下

deeptools bamCoverage \
-p 10 \
--bam input.bam \
--normalizeUsing  RPKM \
--outFileName rpkm.bigwig

2. CPM

CPM的公式如下

CPM (per bin) = number of reads per bin / number of mapped reads (in millions)

用法如下

deeptools bamCoverage \
-p 10 \
--bam input.bam \
--normalizeUsing  CPM \
--outFileName cpm.bigwig

3. BPM

BPM的公式如下

BPM (per bin) = number of reads per bin / sum of all reads per bin (in millions)

用法如下

deeptools bamCoverage \
-p 10 \
--bam input.bam \
--normalizeUsing  BPM \
--outFileName bpm.bigwig

4. RPGC

RPGC的公式如下

RPGC (per bin) = number of reads per bin / scaling factor for 1x average coverage
scaling factor =  (total number of mapped reads * fragment length) / effective genome size

用法如下

deeptools bamCoverage \
-p 10 \
--bam input.bam \
--normalizeUsing  RPGC \
--effectiveGenomeSize 2864785220 \
--outFileName rpgc.bigwig

对于同一个样本而言，导入igvtools中，几种归一化方式产生的bigwig文件和原始的bigwig文件的峰形是完全一样的，示意如下

注意红色方框标记的纵轴的范围，可以看到不同方式，其纵轴范围不一样。

归一化主要用于样本间的比较，比如在比较Input和Ip两个样本时，就应该使用归一化之后的数据，以RPKM为例，导入之后可以看到如下所示的结果

可以看到纵轴的范围是不一致的，为了更好的比较样本间的差异，我们需要把二者的纵轴范围调整成一致的，因为数据已经做了归一化处理，所以可以直接在同一范围内进行比较，设置成同一范围后，效果如下

对于上述多种归一化方式，其实都是可以拿来在样本间比较的。在实际操作中，由于RPKM的概念最为经典，应用的也最为广泛。

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