植物突变体库（二）—

（Ethylmethanesulfonate,EMS）是一种常用的化学诱变剂，能诱发产生高密度的系列等位基因点突变，具有效率高、负作用小、易操作等优点，目前已被广泛应用于植物的相关遗传研究和诱变育种工作中。在当前种质资源极为匮乏，基因资源日益枯竭的状况下，采用EMS诱发突变技术创造有用基因资源具有极其重要的意义。

EMS的特征

①EMS分子式ＣＨ3ＳＯ2ＯＣ2Ｈ5，无色液体，分子量为124。

EMS水中溶解度为8％。pH=７条件下在水中半衰期20°C时为93ｈ，30°Ｃ时为26ｈ。

②EMS能使DNA分子上的嘌呤、嘧啶分子发生烷基化来影响mRNA的转录，随后使蛋白的合成过程发生紊乱，进而改变植物的性状。物理诱变譬如超声波、γ射线、中子等对物种的损伤较大，容易引起碱基的转换、颠换、移码、染色体缺失、易位、倒位等，从而引起生物的突变和死亡。

③相对于其它化学试剂诱变或者物理诱变，EMS诱变具有如下特点：

１）较高的突变频率和较少的染色体畸变。主要是ＥＭＳ诱变使ＤＮＡ分子上产生较多的点突变，对染色体损伤轻而不致引起染色体断裂产生畸变，可以针对农作物的某一特殊性质进行改良。

２）对处理材料损伤轻。ＥＭＳ诱变相对于其它物理诱变的生物损伤小，不容易引起生活力和可育性下降，尤其是无性繁殖的植物由于不经历减数分裂过程繁殖后代，相对于可产生种子的植物，这种突变更容易向后代遗传。

３）成本低廉，操作简便。使用的ＥＭＳ诱变剂处理材料不需要特殊的设备，成本低，一次可以诱变大量的材料，诱变效果较好。

４）ＥＭＳ诱变剂对人体更具有危险性。ＥＭＳ具有强烈的致癌性和挥发性，常用５％硫代硫酸钠作为解毒剂，因此在操作过程中要注意安全防护，严格遵守试验规则。

EMS诱变的方法和技术路线

EMS诱变育种中，诱变材料不同，使诱变效率和筛选难度也有差异。一方面要保证诱变剂的有效渗入，二是要使植物能够顺利生长和发育。种子是理想的处理材料。也可以选择植物的器官和组织进行诱变处理。例如幼穗、花粉、芽、茎、愈伤组织等。

最常用的处理方法有：

１）浸泡法，就是把种子、芽等组织浸泡在适当浓度的诱变剂溶液中。以ＥＭＳ浸泡法构建突变体库最成功的例子就是拟南芥突变体库的构建，通过ＥＭＳ诱变拟南芥种子可以构建覆盖全基因的突变子　。

２）滴液法：在植物茎上划一道较浅的切口，然后将浸透诱变剂溶液的棉球经过切口浸入，此法可用于完整的植株或发育中完整的花序。

３）共培养法：在培养基中用较低浓度的诱变剂处理根或者花药共培养。在ＥＭＳ诱变处理材料的过程中，必须保证有足够的溶液进入细胞，因此被处理的材料必须完全被溶液浸透，如果能够附以搅拌，对增加处理效果。由于ＥＭＳ容易挥发，因此处理温度最好在２０℃　左右，并且在密闭状态下效果较好。

EMS诱变是个复杂的物理和化学过程，尤其是在构建植物突变体库中，为了获得较好的诱变效应，必须正确地掌握EMS诱变剂的最佳剂量。不同的物种对EMS的敏感程度不同，因此对EMS的浓度、处理温度和处理时间的反应效应也不同，必须通过预试验来确定最佳的处理剂量。通常采用预浸种至萌动露白后进行诱变处理，此时种子吸收诱变剂达到最适宜的速率和速度，且此时开始DNA合成，是最敏感的阶段，可以产生较高的突变频率，有望创制并筛选到目的突变体植株。

应用举例——菜心EMS诱变突变体库

3.1 材料与方法

3.1.1 筛选种子EMS诱变最佳处理条件

挑选饱满的菜心高代自交系材料C40和小80天种子，分别设4个处理浓度（0.2%、0.4%、0.6%和0.8%）和3个处理时间（8、12和16 h）。每处理100粒种子，保证药液完全淹没种子，对照（CK）为纯水处理。诱变处理后，先用5% Na2S2O3溶液冲洗种子，终止反应，再用流水冲洗种子2 h，然后播种于装有育苗基质的育苗盘中进行水浮式育苗，成苗后移栽至田间，按常规方法管理。统计并分析诱变后菜心种子的成苗率、长势和结籽株比例等，筛选菜心种子EMS诱变最佳处理条件。

3.1.2 突变体库的构建

挑选饱满的菜心高代自交系小80天种子3000粒，用0.4% EMS处理12 h，然后育苗移栽，获得M1群体，然后对M1群体的植株进行自交授粉收获M2群体种子。随机选取种子量大的176份M2群体种子，挑选15粒饱满种子作为M2群体家系，按照家系双行条播种植，构成M2群体。以野生型菜心小80天为对照，对突变体库M1、M2群体中单株的变异性状进行调查。主要调查性状为株型、薹色、叶色、叶形和花色等。

3.2 结果与分析

3.2.1 最佳诱变条件的筛选

不同EMS处理浓度对菜心种子萌发及生长发育产生不同影响。0.2% EMS处理8 h后菜心种子的成苗率与CK相当，但比CK植株生长旺盛，早抽薹1～2 d，表明低浓度EMS短时间诱变对菜心种子的萌发和生长具有促进作用。随着EMS浓度的增大，菜心种子成苗率和结籽株比例逐渐降低。当诱变处理8 h，EMS浓度为0.6%时，C40和小80天菜心的成苗率分别为65%和70%，结籽株比例为13%和31%;EMS浓度升至0.8%时，C40菜心成苗率降至50%，小80天菜心成苗率变化不明显，结籽株比例均低于20%（图1和图2）。

由图1和图2还可看出，随着EMS处理时间的延长，菜心种子成苗率和结籽株比例逐渐降低。EMS处理浓度为0.4%时，诱变12 h，C40和小80天菜心的成苗率均为75%，结籽株比例分别为30%和45%;诱变16 h，C40和小80天菜心的成苗率分别降至60%和55%，结籽株比例均低于20%，表明EMS诱变不仅会抑制成苗率，还会严重影响结实情况。当EMS浓度为0.6%、处理时间为12 h时，M1群体出苗率接近半致死，但结籽株比例低于20%，不利于突变体库的构建。除了尽可能提高诱变频率外，还必须保证一定规模突变体库的构建，综合比较，最终选择0.4% EMS、诱变处理12 h为构建菜心突变体库的最佳处理条件。

不同基因型菜心材料对EMS的耐受性不同，C40菜心明显弱于小80天菜心。0.4% EMS处理种子16 h，C40菜心的成苗率为60%，基本不结籽，而小80天菜心的结籽株比例为16%;0.6% EMS处理种子12 h，C40菜心与小80天菜心的成苗率相同，但C40菜心生长势较小80天菜心弱，且结籽株比例仅5%，低于小80天菜心。不同菜心自交系材料对EMS的耐受性可能与植株的生长势有关系，与C40菜心相比，小80天菜心植株高大强壮，根系发达。因此，生长势强的菜心自交系EMS处理的时间或浓度可适当增大。

3.2.2 菜心突变体库M1群体表型变异

用0.4% EMS处理3000粒小80天菜心种子12 h，2019株成苗。M1群体幼苗定植于大棚网室，开花期套袋自交，成熟期分单株收获种子。在M1群体中，50%以上植株不结实或结实性差，仅收获500个单株种子。经EMS处理的M1群体植株，长势较CK差异明显，主要表现为植株矮小，叶片黄化、白化（图3-A和图3-B），叶片皱缩、畸形（图3-E和图3-F），叶片为嵌合体（图3-C和图3-D），花色变化（图3-G），丛枝（图3-H）等变异性状。通过对M1群体中自交后代的表型鉴定，发现白化、黄化、嵌合、畸形等一些变异性状不能遗传，可能是EMS化学药剂伤害造成的性状变化。

2.3 菜心突变体M2群体性状变异

随机选取M1群体中种子量大的176个单株，按家系双行条播种植，共获得176个家系的2110个成活的M2单株，构成M2群体。在M2群体中，全生育期内对其表型进行调查，发现表型变异株，包括叶形、叶色、株型、花色、生育期等五大类突变。

参考文献

[1]张艳, 洪晓如, 黎庭耀,等. 菜心EMS诱变条件优化与突变体库构建[J]. 南方农业学报, 2021.

赛思基因（www.scientsgene.com），专注遗传转化技术的应用于开发，致力于打破基因型限制，助力基因编辑育种。

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