2020.11.17【读书笔记】丨ONT 测序平台送样指导—

送样原则
- 安全
  - 1. 人身安全：现有实验条件下（采取一定防护后），样品对实验人员本身无伤害；
  - 2. 环境安全：样品对室内、室外环境无影响（以免因为不小心导致一些活体样本进入外界环境造成不良影响）；
- 无污染
  - 任何样品除本样品外不得有其他样品的污染，
    - 植物样本不得有其它植物的污染，不得有病害，不得有虫害
    - 全血样品不得引入取血物种本身携带的病菌、病毒等潜在污染
- 依据理论和实践
  - “理论”：基于各种实验原理的理论依据；
  - “实践”：基于 BMK 本身积累的多物种、多样品的项目经验；
- 说明
  - 客户或销售人员应将样本的信息详细说明，所有样品必须标注好关键样品信息
  - 样品信息单必须早于或与样品同时到达公司，一则方便样品中心录样，二则方便项目尽快启动
  - 因为样品首次取样不足、质量不好或信息单未及时到位造成项目进度延后时需要由客户或销售部承担相关责任
  - 因公司内部培养条件不能同时满足各种物种的生长需求，因此，如送活体的话，送达活体样品应该尽量是送到即可进行实验的样品（量足，质好），不建议在公司保存过长时间，防止培养样本死亡
  - 所有活体样品（包括离体枝条），必须在寄送前详细填写样品信息单（包括但不限于：可能进行的实验方案、如何取样、是否保证取样后存活、是否需要返样），并且提前邮件通知样品中心及相关实验人员；特殊物种需要书面告知材料培养条件
植物
- 1.植物样本
  - 总体取样要求
    - 样品状态优先选择顺序：幼嫩健康---成熟健康；
    - 组织部位优先选择顺序：优先选择叶片(含叶芽)；
    - 不建议选择易带有寄生或共生生物的组织，以及不易清洗和研磨的根、茎等组织致密的器官；
- 1.1 活体植株取样要求：
  - 1.1.1 幼嫩植株：种子培育的低龄幼苗、组培苗；
  - 1.1.2 成熟植株：保证存活状态，生长趋势良好；
  - 1.1.3 取样量：见“ONT 测序平台送样指导——动植物 DNA 相关产品 _BMK190107”文档；
  - 1.1.4 其它：特殊贵重活体样品需要客户提供样品的种植、保存条件、营养液，以保证样品的正常生长；
- 1.2 离体枝条取样要求：
  - 1.2.1 枝条选择：枝条顶端有待萌发叶芽，且叶芽周边有几片幼叶；枝条中下端保留部分成熟叶片；
  - 1.2.2 枝条预处理：剪断枝条，自底端往上约 5cm 用浸透水的吸水纸包裹好，放入自封袋，袋中喷水，填充部分空气，密封袋口；
  - 1.2.3 枝条运输：自封袋放入泡沫箱，箱体内侧壁放部分冰袋（保证低温运输），冰袋与自封袋间放置泡沫板，防止冰袋积压样品或因冰袋与样品直接接触导致样品被冻伤；或者由专人携带至公司，立即交给实验人员；
  - 1.2.4 运输时间：保证 24h 内到样，最多不得超过 3 天；
  - 1.2.5 取样量：详细不同产品取样量请见“ONT 测序平台送样指导——动植物 DNA 相关产品 _BMK190107”文档；
- 1.3 冻存样品取样要求：
- 1.4 植物取样注意事项：
  - 活体样品寄送前，请详细填写“样品信息单”（包括但不限于：样品处理方式、是否保证取样后样本存活、是否需要返样），并通过邮件方式告知样品中心、相关部门实验人员；
  - 所有待取的幼嫩组织长势必须正常（无病虫害、无营养缺失）；
  - 因为通常裸子植物比被子植物更难选择适合的解离液，裸子植物的叶子大多为针形、线形、鳞形，叶片表面有较厚的角质层，细胞内次生代谢物多，这对提取完整的细胞核极为不利，因此，选取萌发的新鲜幼苗作为材料会更合适；
    - 1.3.1 样品选择：请尽量选择健康、幼嫩的叶片组织，不建议选择易带有寄生或共生生物的组织，以及不易清洗和研磨的根、茎等组织致密的器官。
    - 1.3.2 样品预处理：取材后将叶片表面灰尘及泥土冲洗干净；用 75%酒精擦拭消毒表面；去离子水冲洗 3 次，吸干水份；用锡箔纸包裹并标注，立即液氮速冻，保存于液氮或超低温冰箱中。
    - 1.3.3 样品运输：干冰运输
    - 1.3.4 取样量：见“ONT 测序平台送样指导——动植物 DNA 相关产品 _BMK190107”文档；
动物
- 1. 动物（Animals）样本---全血液（Blood）
  - 1.1 血液样本
    - 1.1.1 全血样品取样要求
      - 血液采集后加入含 EDTA 或柠檬酸钠抗凝管中，轻轻颠倒十次混匀，室温正立放置，平衡 2h 后立即送样，并尽量确保 24h 内运至实验室；
    - 1.1.2 血液需求量
      - 见“ONT 测序平台送样指导——动植物 DNA 相关产品_BMK190107”文档；
    - 1.1.3 全血取样注意事项（防止污染、溶血）：
      - a. 取样前要做好消毒处理：包括取样部位、取样器材、取样者戴的手套等，防止所取血液样品被物种本身携带的细菌等污染物污染；
      - b. 准备柠檬酸钠或 EDTA 抗凝管（抗凝管有多种规格）；
      - c. 依据抗凝管的实际规格采取全血样品，比如：10ml 规格的抗凝管可以取样 10ml；
      - d. 取完血后，迅速轻柔颠倒混匀全血样品，保证血液与抗凝剂充分混匀；
    - 1.1.4 全血样品寄送注意事项
    - a.天气较热时：含有血液样品的抗凝管运输时使用冰袋低温运输，注意，冰袋不要与抗凝管直接接触，以防止血液冻凝；
    - b.天气较冷时：含有血液样品的抗凝管运输时无需加冰袋运输；
    - c.寄送血液样本前，请详细填写“样品信息单”，通过邮件方式告知样品中心、相关实验人员。
  - 1.2 提供活体物种，用于血液采集（不建议）
    - 如遇特殊情况确需提供活体，客户需提供一定的技术支持，并需提前与样品中心、实验中心沟通，得到肯定答复后，由专人将活体携带至公司，并保证至少可取 4ml 样品；
    - 注：因公司条件有限，且项目物种多样化，不同物种取血样操作也不尽相同，还是建议客户自己抽取血样，不建议送活体样本；
- 2 . 动物（Animals）样本---肌肉（Muscle）
  - 2.1 组织样品
    - 2.1.1 取样要求
      - 取材尽量选择肌肉、肝脏组织或血液，尽量不要取用易于寄生微生物的表皮和肠道、可能有变异细胞的病变组织；
    - 2.1.2 样品冻存
      - 活体取材后立即用 PBS 或 0.9％生理盐水漂洗，去除血渍和污物，并剔除结缔组织和脂肪组 5 织等组织，吸干水份后分割成小块；.将处理好的组织样品保存于 2 mL 或更大体积的旋盖冻存管（已标记）中，立即液氮速冻 30min 以上，保存于超低温冰箱中或立即使用干冰寄送；
    - 2.1.3 样品寄送注意事项
      - 将样品管用封口膜封口，再放置于 50mL 离心管中或封口袋中，里面添加棉花等固定（切勿在 50 mL 管内或其他支撑物内加入液氮等危险品），干冰运输应保证组织样品新鲜冻存，保存时间不要太长；
  - 2.2 活体样品（不建议）
    - 特殊项目若确需送活体样品，需提前与样品中心、实验中心沟通，得到肯定答复后，由专人将活体携带至公司；客户需提供一定的技术支持（如解剖指导图谱），以方便实验中心拿到样品后可以尽快正确处理样品；
  - 2.3 肌肉（冻存&活体）
    - 组织样品理论用量
      - 见“ONT 测序平台送样指导——动植物 DNA 相关产品_BMK190107”文档；
- 3. 动物（Animals）样本---昆虫（Insect）
  - 3.1 取样要求
    - 昆虫样品的优先选择顺序：卵---新孵化幼虫----蛹---成虫；
  - 3.2 昆虫样品量要求
    - 见“ONT 测序平台送样指导——动植物 DNA 相关产品_BMK190107”文档；
  - 3.3 昆虫样品注意事项
    - 昆虫存在杂菌、其它植物等物种的潜在污染：因为这种样品个体很小，只能整只提取，肯定会把肠道、口腔、体表微生物及共生菌（Wolbachia）一起提出来，会导致多种菌类污染；
    - 说明：
      - 1.所有进行过饲喂的昆虫样品送样时需要标注饲喂条件；（不建议寄送活体）
      - 2.昆虫项目因个体差异性，所以具体用量和取样条件还需要针对不同物种特异性对待！
      - 3.所有活体动物样品送样时一定要注意按照其实际生活习性进行谨慎打包处理，尤其注意样品的保存温度(受季节影响显著)，并保证样品呼吸通畅(O2)：
        
        1）不要密封送样，应保证活体样品呼吸通畅；
        
        2）不要温度过高或过低送样，需要根据样品的具体生活习性进行谨慎打包处理；
微生物（Microorganism）
- 1. 微生物（microorganism）样本-真菌（fungus）
  - 1.1 真菌送样要求
    - 总体取样要求
    - 状态：对数生长期总量：菌体总量约 3-5g
    - 1.1.1 提供“真菌菌株”样品，并同时提供以下材料和信息（不建议）
      - 1) 提供适于此菌株的液体培养基---可配置 1L 左右液体培养基（可直接提供粉末试剂，到公司后再进行溶解、灭菌，需要提供配方）；
      - 2) 提供此真菌的孵育条件，如：温度，摇床转速，培养时间；
      - 3) 提供此菌种和相应菌液的保存条件；
      - 4) 其它需要注意的事项；
    - 1.1.2 培养基送样
      - 对数生长期菌液 0.5-1L 或固体平板（确保收菌量 3-5g），常温或 4℃运输。
      - 注：平板建议用一次性平板避免碎裂，液体培养基注意封口严密避免漏液，不建议提供固体培养基培养的真菌（因菌丝量太少，会拖延项目周期）！
    - 1.1.3 菌体送样离心收集对数生长期真菌，PBS 洗涤 2-3 次去除培养基，吸弃所有液体后立即液氮速冻 30min 以上，保存于超低温冰箱中或立即使用干冰寄送。
  - 1.2 细菌送样要求
    - 总体取样要求
    - 状态：对数生长期；总量：菌体总量约 0.5-2g；
      - 1.2.1 培养基送样
        
        对数生长期菌液 6-10ml 或固体平板（确保收菌量 0.5-2g），常温或 4℃运输。注：平板建议用一次性平板避免碎裂，液体培养基注意封口严密避免漏液。
      - 1.2.2 菌体送样
        
        离心收集对数生长期细菌，PBS 洗涤 2-3 次去除培养基，吸弃所有液体后立即液氮速冻 30min 以上，保存于超低温冰箱中或立即使用干冰寄送。

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