本章导读

5.1把目的基因导入大肠杆菌

5.1.1 自然条件下的转化过程

5.1.2感受态受体细胞选择

5.1.3外源目的基因导入到肠杆菌的方法

（1）CaCl2转化法

CaCl2转化法程序

(2）电穿孔转化法

5.1.4 外源基因通过噬菌体转导进入受体细胞

5.2目的基因导入酵母细胞

5.2.1 PEG介导的酵母转化

5.2.2 金属阳离子介导的酵母转化

5.3 目的基因导入植物细胞

5.3.1 DNA直接转移法

1、化学刺激法

2.电击法

3.显微注射法

4.基因枪法（particle gun）

5.脂质体介导法

6.激光微束介导的基因转化

7.花粉管通道法

5.3.2根瘤农杆菌介导法

（1）Ti质粒的结构组成

（2）T-DNA的结构与功能

(3)根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的分子

农杆菌Ti质粒转化机理

T-DNA的加工及转移

T-DNA的复制

T链蛋白复合物的形成

T链复合物通过细胞膜的转运

VirB蛋白分为五类

小结

（4）T-DNA转移的影响因素

（5）Ti质粒衍生的载体系统

改造原则

转化Ti质粒载体系统的构建

一元载体系统的构建

共整合载体(一元载体）的构建

双元载体系统的构建

辅助Ti质粒(helper Ti)

微型Ti质粒

二元载体构建及应用

二元载体较一元载体比较

5.4目的基因导入动物细胞

5.4.1外源基因导入离体培养的动物细胞

5.4.2外源基因导入在动物体细胞

（1）显微注射法

（2）逆转录病毒法

逆转录病毒的优点和缺陷

（3）体细胞核移植（NT）

体细胞核移植法的优点

（4）精子载体法

本章导读

外源基因导入受体细胞有多种方法，细胞类型不同，载体不同，导入方法也有差异。本章主要介绍将外源基因导入大肠杆菌细胞、导入酵母细胞、导入植物细胞以及导入动物细胞的不同方法。每种方法都有其独特的优点，但也有不足，因此，选择什么样的方法将外源基因导入受体细胞,需要根据具体情况来确定。

5.1把目的基因导入大肠杆菌

5.1.1 自然条件下的转化过程

5.1.2感受态受体细胞选择

限制缺陷型 hsdR-：增大外源DNA的可转化性。

重组缺陷型 rec-：

转化亲和性：用于基因工程的受体细胞必须对重组DNA分子具有较高的可转化性。

遗传互补型如a-互补：带有与载体携带的选择标记遗传互补的性状，才能使转化成功。

感染寄生缺陷型：有些细菌细胞对生物如人和牲畜有感染和寄生效应，重组DNA分子导入受体细菌，随之受到感染寄生作用，进入生物体，广泛传播。

5.1.3外源目的基因导入到肠杆菌的方法

（1）CaCl2转化法

核心:是将对数生长期大肠杆菌细胞在低温CaCl,水溶液中一段时间，经过处理后大肠杆菌细胞对DNA的吸附能力显著提高，转化效率可达10^7-10^9转化子/ ug DNA。

CaCl2转化法程序

(1) 用100mmol/L的CaCl2处理对数生长期大肠杆菌细胞，制备感受态细胞;

(2）将DNA分子与感受态细胞混合，使DNA黏附在细菌细胞膜表面。

(3）在42℃水浴中热激90 s，致使膜通透性增加，DNA进入细胞，冰浴中恢复1-2 min。

(4）复苏:在营养丰富的培养基上37℃恢复培养45-60 min。

（不能加抗生素，）

(2）电穿孔转化法

电穿孔转化法亦称电转化法或电激法，是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上形成可逆的瞬间通道，从而促进外源DNA进入原生质体。

细胞悬浮液中尽量减少导电离子。

5.1.4 外源基因通过噬菌体转导进入受体细胞

有噬菌体将细菌基因由一个细菌（供体）转移到另一个细菌（受体）的过程。

phage 在供体裂解中，部分供体DNA被包装，当感染

5.2目的基因导入酵母细胞

酵母转化可使用电激法、PEG法、醋酸锂等。

5.2.1 PEG介导的酵母转化

PEG（聚乙二醇）法的主要原理是利用化学试剂，如聚乙二醇、聚乙烯醇(PVA）、多聚-L-鸟氨酸(pLO）和磷酸钙等，诱导原生质体摄取外源DNA分子，进入原生质体的外源DNA分子就有可能通过某种机制整合到基因组中，完成遗传转化过程。

缺点:需要原生质体和细胞再生；转化体中二倍体和多倍体比例高。

5.2.2 金属阳离子介导的酵母转化

醋酸锂（LiAc）诱导转化

PEG加醋酸锂诱导大幅度提高转化效率。

5.3 目的基因导入植物细胞

5.3.1 DNA直接转移法

1、化学刺激法

植物原生质体用PEG、磷酸钙等处理，诱导原生质体摄取外源DNA分子，完成遗传转化过程。

2.电击法

利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上产生瞬时通道。

3.显微注射法

利用显微注射仪将外源DNA分子直接注射到细胞质或细胞核，实现外源基因的转移。

目前有3种细胞固定技术:琼脂糖包埋法，多聚L-赖氨酸黏连法，吸管支持法。

4.基因枪法（particle gun）

将外源DNA包裹在微小金粒表面，高压作用射入受体组织和细胞内部。

基因枪的步骤：DNA微弹的制备；靶外植体材料准备；DNA微弹轰击；轰击后外植体的培养。

5.脂质体介导法

利用脂类化学物质包裹外源DNA成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把外源DNA的脂质体转入受体细胞。

6.激光微束介导的基因转化

将激光引入光学显微镜聚焦成微束，细胞膜上形成自我愈合小孔，使培养基的DNA流入细胞。

7.花粉管通道法

授粉后使外源基因沿着花粉管渗入，通过珠心通道进入囊胚，转化不具备正常细胞壁的卵。

5.3.2根瘤农杆菌介导法

根癌农杆菌（Agrobacterium tume faciens）广泛侵染双子叶植物和裸子植物。

根据根癌农杆菌诱导植物细胞形成的根瘤中冠瘦碱的不同可将根癌农杆菌分为章鱼碱型( octopinetype）、胭脂碱型(nopaline type）和农杆碱型( agropine type）3种类型。

（1）Ti质粒的结构组成

根瘤农杆菌内致瘤质粒（tumor inducing plasmid），简称Ti质粒。

当根瘤农杆菌感染植物时，菌体本身不进入植物细胞内，仅Ti质粒一部分“T-DNA”DNA片段进入寄主细胞并插入基因组中，T-DNA中的基因利用植物的酶系统进行转录和翻译，其表达的产物可以诱发植物产生肿瘤。

根癌农杆菌：T-DNA转移功能区，基因表达把T-DNA转移到植物DNA中。

（2）T-DNA的结构与功能

T-DNA携带的遗传信息：

致瘤基因：含有转化植物细胞的基因，给与植物不受控制的繁殖能力——致癌基因或onc基因。

生长素auxin基因：AuX基因，合成IAA。
细胞分裂素cytokinin基因：cyt基因。

共同特点：表达产物将导致被转化植物的细胞内激素平衡紊乱，冠瘿瘤细胞无限生长产生肿瘤。

冠瘘碱合成酶及其分解基因:使植物细胞合成某种冠瘘氨基酸的基因。如nos（编码胭脂碱合成酶的基因）。

(3)根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的分子

机理：

农杆菌Ti质粒上的T-DNA导入植物基因组整个过程大致可分为:

①农杆菌对受体的识别;
②农杆菌附着到植物受体细胞;
③诱导启动毒性区基因表达;
④类似结合孔复合体的合成和装配;
⑤ T-DNA的加工和转运;
⑥T-DNA的整合。

VirG作为转录因子作为调控因子，结合启动子元件激活基因表达。依次表达活性基因

农杆菌Ti质粒转化机理

农杆菌附着到植物细胞后，只留在细胞间隙中。
T-DNA首先在细菌中被加工、剪切、复制，然后转入植物细胞，并非整个Ti质粒都进入植物细胞。

T-DNA的加工及转移

Vir基因操纵子系统被活化，VirD表达，在边界重复序列的特定位点形成切点，产生单链断裂。
T链的合成:从右边界至左边界，目前认为T-DNA是以T单链形式向植物细胞转移的，而不是双链的T-DNA分子。
在右边界的右边约17bp的超驱动序列，可使T链的形成大大增加，故称作“转化增强子( Transfer enhancer），除去增强序列导致菌株致病力消失。
Vir D:编码VirD1和VirD2两种蛋白，一起决定内切酶活性

T-DNA的复制

在下链25bp重复序列的右边界左起第三和第四碱基间缺口剪接。
从缺口3端开始合成新的DNA链，并一直延伸到左边界第22碱基处，置换出原来的下链，形成ssDNA，即T链。

T链蛋白复合物的形成

VirD2与T链5端共价结合避免5’一核酸酶攻击，VirD2为靶向核的“向导”，VirD2C端有特异AA序列，可作为核定位信号。

VirE2编码ssDNA结合蛋白（保护单链，防止降解），此蛋白非特异性地结合任何ssDNA，VirE2可包被T链，形成长的核蛋白丝，起保护作用，在Vir诱导的农杆菌中，E2蛋白最多。同时使T链成为运转形式（解折叠成为细丝) 。

T链复合物通过细胞膜的转运

①跨膜及膜结合蛋白的特性

>穿膜通常需要在蛋白质N一末端有一信号肽，信号肽可帮助跨越细菌内膜（IM）完成后特异肽酶切除信号肽，转运停止。

>T链复合物运转的活性物质可能是VirB蛋白。

VirB蛋白分为五类

>R:在内膜上或内膜内的某些蛋白，可能作为T复合体的受体。

>A:蛋白可能作为能源，作为一种ATP酶促使T复合体被泵出细菌细胞。VirB11可能是这种“A”类蛋白。

>C:起形成通道的作用，VirB4可能是“C”蛋白。VirB4是一种富集蛋白，无疏水区，无信号肽，可能在T链转运中起一种结构作用，形成至少一部分特殊的通道结构。

>S:载体蛋白，起运载T复合体穿过通道的作用，这类蛋白可能与所有的膜成分（内膜及周质）有关。

>P:位于外膜上，可能作为结合植物细胞膜的一种受体。最终定向转移到植物细胞上。

T链复合物靶向植物细胞核

目前已知VirD2及VirE2有核定位信号(nuclearlocalizing signal，简称NLS）。

VirD2N端50%已足以特异地剪切T-DNA的边界序列(内切酶活性），C端50%则含NLS(核定位作用）。

T-DNA链整合植物基因组的分子机理

整合的随机性及其位点特异性

>遗传作图的分析表明，T-DNA在植物染色体中的插入是随机的。它可插入任何一条植物染色体。

T链插入位点特点

(1) T-DNA优先整合到转录活跃的植物基因位点;

(2) T-DNA与植物DNA连接处富含A.T碱基对，氢键结合较弱;

(3)同源插入:植物DNA上的插入靶位点与T-DNA边界序列有一定程度的同源性，使得插入的T-DNA和靶序列能互相靠近，并有效地发生DNA链的交换。

(4)植物基因组靶序列附近有一段( dG-dT)10序列。此序列是真核基因组中保守的高度重复序列。当DNA处于负超螺旋时，该重复序列极易形成Z-DNA（容易发生解链）,使位于它附近的序列部分解旋，为DNA重组，T-DNA插入提供位点。

小结

趋化性→

细菌附着到植物受伤细胞上→

植物化学信号诱导Ti质粒的Vir基因的表达→

Vir基因产物加工T-DNA形成单股DNA片段，T链蛋白复合物的形成，T链复合物靶向植物细胞核→

T链复合物被转入植物细胞，整合到寄主基因组中→

T一DNA基因被表达，使植物细胞增殖并产生冠瘤碱

（4）T-DNA转移的影响因素

农杆菌菌株（EHA105、GV3101）
农杆菌高侵染活力的生长周期
基因活化的诱导物
外植体的类型和生理状态——利福平：抗生素
外植体的预培养——烟草：切完就转化；预培养下胚轴伤口位置产生薄壁组织，提高转化效率。
外植体的接种及共培养——共培养加羧苄。

（5）Ti质粒衍生的载体系统

野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体存在许多障碍：

①T-DNA区的onc基因产物属植物激素类，会干扰受体植物内源激素的平衡而诱发肿瘤，阻碍转化细胞的分化和再生;
②Ti质粒存在一些对T-DNA转移不起任何作用的序列如冠瘘碱合成基因;
③质粒过大（一般120kb左右），操作困难;
④大型的Ti质粒上有各种限制酶的多个切点;
⑤Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，而农杆菌本身的遗传背景又不太清楚

改造原则

①使载体具备2个DNA复制原点。一个作为大肠杆菌的复制位点，一个作为农杆菌的复制位点，即构建称为大肠杆菌-农杆菌穿梭载体;
②至少具备2个筛选标记:一个是植物选择标记基因，便于转化植物细胞后的选择;一个是细菌的选择标记，便于载体构建和克隆的筛选;
③减小质粒分子量。天然质粒由于分子量太大不利于克隆操作因此要尽量减小质粒分子量。通常将T-DNA上的三个结构基因去除，代之以目的基因和植物筛选标记。同时将Ti质粒上其他非必须序列也要去除。
④删除质粒上多余的酶切位点，增加多种酶的单一酶切位点即多克隆位点。

转化Ti质粒载体系统的构建

目前主要采用两种Ti质粒载体系统的构建。

一元载体系统、二元载体系统。

农杆菌存在两个质粒：双元载体。

一元载体系统的构建

一元载体：共整合质粒，中间表达载体和卸甲载体TI通过同源重组产生一种复合型载体，称为共整合载体（co-integrated vector）。

特点：

(1）由两个质粒(E.coli质粒和Ti质粒)重组而成，分子量较大;
(2）重组频率决定共合体的形成频率，相对较低;
(3）共整合体质粒通过Southern杂交或PCR检测。

共整合载体(一元载体）的构建

特点:中间表达载体与受体Ti卸甲载体通过同源重组共整合构建。

举例:共整合载体的典型代表是pGV3850，共整合载体构建通过三个步骤:

1)中间载体导入农杆菌
2)中间载体与受体Ti质粒的同源重组
3)共整合载体的筛选

T-DNA内部的onc缺失区被pBR322序列（含Ampr基因）所取代。
含pBR交换序列的卸甲载体。

双元载体系统的构建

双元载体(binary vector)系统是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变质粒构成的双质粒系统;
T-DNA与Vir基因在两个独立的质粒上，通过反式激活T-DNA转移，故称之为反式载体(trans vector)。
包括辅助Ti质粒和微型Ti质粒。

辅助Ti质粒(helper Ti)

T-DNA缺失，因此完全丧失致瘤功能，含有Vir区段。
主要作用是提供Vir基因功能，激活处于反式位置的T-DNA转移，因之称为辅助质粒。
常用辅助Ti质粒:pAL4404(根癌农杆菌LBA4404)为章鱼碱型Ti质粒pTiAch5的衍生质粒。（本身已经存在于农杆菌！！！）

微型Ti质粒

微型Ti质粒(mini-Ti plasmid)——真正操作的质粒。

mini-Ti是含有T-DNA边界，缺失Vir基因和致瘤基因的Ti质粒，因而转化的植物不会产生肿瘤。
Mini-Ti具有复制位点ori及选择标记基因。

优点:质粒小、宿主广，带有LacZ（蓝白斑）及植物选择标记，多克隆插入位点，外源基因易插入。

新霉素磷酸转移酶Ⅱ基因

二元载体构建及应用

①构建两个Ti质粒:即微型Ti质粒和辅助Ti质粒;

②重组:将外源基因重组于微型Ti质粒上;

③转移:重组的微型Ti质粒转入含有辅助Ti质粒的根癌农杆菌菌株中;

④侵染:根癌农杆菌中两种Ti质粒通过反式作用将含有外源基因的T-DNA区转移到植物组织细胞中。

二元载体较一元载体比较

二元载体较一元载体有更多的优点:

>首先，二元载体的构建较为方便;而一元载体还需在根癌农杆菌中进行共整合，构建效率相对较低。

>其次，二元载体的外源基因的转化效率要高于一元载体。

所以目前在植物基因工程研究中主要使用二元载体系统。

5.4目的基因导入动物细胞

5.4.1外源基因导入离体培养的动物细胞

(1）物理转染法:电穿孔法、电击法、显微注射法、基因枪法、超声波法;
(2）化学转染法:磷酸钙共沉淀法、脂质体法、原生质体融合法;
(3）病毒感染法。

5.4.2外源基因导入在动物体细胞

（1）显微注射法

在显微镜下将体外构建的外源目的基因，用注射针注射到动物受精卵中，使之与动物基因组整合，从而得到转基因动物的方法。

显微注射不足

方法复杂，技术性强，设备昂贵；

胚胎受机械损伤较大使存活率下降；

外源基因整合效率低；

随机整合或随机插入，存在插入突变的风险。

（2）逆转录病毒法

反转录病毒是一种整合型单链RNA病毒，其生活周期包括:

病毒侵入细胞;
病毒的RNA基因组在细胞质中反转录成双链的前病毒DNA(复制形式DNA);
前病毒DNA被传送至细胞核，并最终整合到宿主染色体上;
整合后的前病毒DNA进而使用宿主细胞的RNA聚合酶转录自己;
最后，部分转录的信息被翻译成病毒蛋白质，组装成新的病毒。

逆转录病毒的优点和缺陷

优点:

逆转录病毒载体可同时感染大量胚胎，也可感染稍晚阶段的不同发育时期的胚胎;
高效率感染并能在宿主细胞DNA上高度整合，可以大大提高基因的转移效率。

缺点:

导入外源基因小于10Kb
容易激活原癌基因
整合后甲基化，表达效率低

（3）体细胞核移植（NT）

将动物早期胚胎卵裂球或动物体细胞核移植到去核受精卵或成熟的卵母细胞胞质中，从而获得重构卵，恢复细胞分裂，继续发育。

体细胞核移植法的优点

基因转移效率大为提高；
转基因动物后代数目迅速扩增；
阳性细胞作为核供体，产生的后代个体100%为转基因个体；
可以实现大片段基因的转移；

（4）精子载体法

精子载体法是将精子适当处理，使其携带外源目的DNA片段进入卵细胞，使之受精，并使外源DNA整合到染色体中，从而获得转基因动物。

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基因工程-5-目的基因导入受体细胞的方法

本章导读

5.1把目的基因导入大肠杆菌

5.1.1 自然条件下的转化过程

5.1.2感受态受体细胞选择

5.1.3外源目的基因导入到肠杆菌的方法

（1）CaCl2转化法

CaCl2转化法程序

(2）电穿孔转化法

5.1.4 外源基因通过噬菌体转导进入受体细胞

5.2目的基因导入酵母细胞

5.2.1 PEG介导的酵母转化

5.2.2 金属阳离子介导的酵母转化

5.3 目的基因导入植物细胞

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（1）Ti质粒的结构组成

（2）T-DNA的结构与功能

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农杆菌Ti质粒转化机理

T-DNA的加工及转移

T-DNA的复制

T链蛋白复合物的形成

T链复合物通过细胞膜的转运

VirB蛋白分为五类

小结

（4）T-DNA转移的影响因素

（5）Ti质粒衍生的载体系统

改造原则

转化Ti质粒载体系统的构建

一元载体系统的构建

共整合载体(一元载体）的构建

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