干货分享 | 诺奖表观应用技术之KAS-seq助力转录活性调控研究
2022年10月5日，三位科学家因在“点击化学和生物正交化学” 方面的贡献荣获诺贝尔化学奖。点击化学和生物正交化学将化学带入功能化学时代，并对生物、医药等领域的研究和发展产生深远的影响。APExBIO组学服务部的研发团队一直紧跟研究前沿，目前已对外推出应用该方法的科研服务项目：KAS-seq。
1 点击化学和生物正交化学
1.1 点击化学
1998年，诺贝尔化学奖得主之一，K. Barry Sharpless初步提出的一个合成概念，即以分子功能为导向，通过小单元的简便拼接，快速可靠地完成各种各样分子的化学合成。其中，叠氮化物和炔之间的1,3-偶极环加成反应是点击化学中的代名词[2]。
最具代表性的反应是一价铜离子催化的叠氮化物-端炔烃环加成反应（CuAAC），由Morten Meldal在2001年发现的，该反应是叠氮化合物和炔化合物在加入铜离子后，高效地将两部分以共价的形式结合在一起[3]。这种反应现在被广泛用于以一种简单的方式将分子连接在一起，推动化学进入功能化学时代。
1.2 生物正交化学
生物正交化学的概念最初是指偶联反应，随后三位诺奖得主中的唯一女性得主Carolyn R. Bertozzi提出，在活体细胞或组织中，能够在不干扰生物自身生化反应条件下可以进行的化学反应。比如研究某种物质在体内的分布情况，可以在该物质上添加一个不会影响其物质性质和生化反应的小基团（比如后文中提到的叠氮基团），另外再加入一种带有荧光等标记的炔基分子，在生物体内叠氮基团与炔基共价结合，这样通过荧光标记我们就可以知道该物质的分布等信息[4]。
Bertozzi发现叠氮化物就是生物正交化学中的一种非常理想的“化学抓手”物质。首先，其对生物体以及细胞都不会产生影响；第二，叠氮化物可以进入生物体内；第三，可以在叠氮化物上可以连接标记分子如荧光分子。后来，Bertozzi将自己的研究成果与点击化学研究进展相结合，还发现了应变促进炔叠氮化物环加成反应，即如果一个环状的化学结构中存在炔基，在不需要铜离子存在的情况下，叠氮化物和炔基也能高效发生反应，即DBCO-A与N3-B[5]。这样通过点击化学和生物正交化学把分子快速连接在一起，同时避免了铜离子对生物体的毒性，最大程度降低对细胞产生的影响，更好的应用于探索细胞中的生物分子间的相互作用以及对疾病过程进行研究。该技术目前正在全球范围内用于绘制细胞的功能图谱。一些研究人员现在正在研究如何利用这些反应来诊断和治疗癌症。
根据CAS Content CollectionTM 统计数据显示，2010年至2020年，影像成像是生物正交化学最大的应用方向，其次是药物开发和递送。其中蛋白质的生物正交的文章数量最多，其它如DNA、RNA以及聚糖领域等也在稳步增长。现在这些反应在组学分许、疾病诊断、药物开发、活细胞成像等多个领域都展示了广阔的应用前景。
2 生物正交化学在表观基因组学中的应用
2.1 转录活性&增强子活性检测与生物正交化学
2020年4月6日，何川团队在Nature Methods上发表了题为Kethoxal-assisted single-stranded DNA sequencing captures global transcription dynamics and enhancer activities in situ的工作。该方法可以在低至1000个细胞或冷冻小鼠组织中对转录以及其他过程中产生的单链DNA实现快速、灵敏的检测[1]。
在KAS-seq实验过程中，作者将N3-kethoxal加入细胞培养液中五分钟后提取DNA，富集被N3-kethoxal标记的DNA片段并建库测序。KAS-seq信号显著富集在基因编码区，并在启动子上与ATAC-seq以及活跃转录的组蛋白修饰信号如H3K4me3/ H3K27ac上高度重合，说明KAS-seq可检测增强子活性[1]。
在gene body上，KAS-seq信号与H3K36me3信号相吻合，而ATAC-seq以及基于KMnO4氧化的ssDNA-seq在此区域均没有信号，说明KAS-seq具有极高的灵敏度。当Pol II延伸被抑制时，KAS-seq信号仅出现在启动子；而当Pol II结合被抑制时，KAS-seq信号在基因编码区完全消失。使用KAS-seq信号定义的四种基因转录状态与使用GRO-seq定义得到的结果相吻合(GRO-seq需使用百万细胞)。KAS-seq也同时检测Pol I 和Pol lIII介导的转录活性[1]。这些证据表明，KAS-seq可准确检测全基因组DNA转录活性。
2.2 KAS-seq与转录活性的应用
2022年4月，Znhit1 controls meiotic initiation in male germ cells by coordinating with Stra8 to activate meiotic gene expression. 作为Dev Cell封面文章，证明Znhit1作为SRCAP染色质重塑复合物的一个亚基，与Stra8协同激活减数分裂基因表达来控制雄性生殖细胞减数分裂的启动。其中，通过KAS-seq，发现Znhit1缺失，显著减弱了减数分裂基因Meiosin,Meioc,Sycp3的转录信号以及转录泡的形成[6]。
2.3 KAS-seq与G4的应用
G4结构是由一条DNA链形成，剩下另外一条富含C碱基的单链。既往研究通过KAS-seq技术证明即使转录和转录延伸被抑制时，ssDNA也可以稳定存在。2022年2月，Nucleic Acids Research期刊发表了Genome-wide mapping of G-quadruplex structures with CUT&Tag，研究者通过ESC的KAS-seq数据，发现G4结构峰处存在ssDNA。继而发现了DNA单链酶消化方案，可提高测G4的分辨率[7]。同时，提示KAS-seq可能得到G4s的相关信息。
参考文献
1.Wu, Tong; Lyu, Ruitu; You, Qiancheng; He, Chuan (2020).Kethoxal-assisted single-stranded DNA sequencing captures global transcription dynamics and enhancer activity in situ. Nature Methods, 17(5), 515–523.
2.Ziegler, K.; Sauer, H.; Bruns, L.; Froitzheim-Kühlhorn, H.; Schneider, J. Über Vielgliedrige Ringsysteme XIV: Cycloolefine Mittlerer Ringgröße. Justus Liebigs Ann. Chem. 1954, 589 (2), 122–156.
3.Tornøe, C. W.; Meldal, M. Peptidotriazoles: Copper(I)-catalyzed 1,3- dipolar cycloadditions on solid-phase, Peptides 2001, Proc. Am. Pept. Symp.; American Peptide Society and Kluwer Academic Publishers: San Diego, 2001; pp 263-264.
4.Pamela V Chang, Jennifer A Prescher, et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Feb 2;107(5):1821-6.
5.Bertozzi et al. (2010) Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132:3688.
6.Sun S, Jiang Y, Zhang Q, Pan H, Li X, Yang L, Huang M, Wei W, Wang X, Qiu M, Cao L, He H, Yu M, Liu H, Zhao B, Jiang N, Li R, Lin X. Znhit1 controls meiotic initiation in male germ cells by coordinating with Stra8 to activate meiotic gene expression. Dev Cell. 2022 Apr 11;57(7):901-913.e4.
7.Jing Lyu, Rui Shao, Philip Yuk Kwong Yung, et al. Genome-wide mapping of G-quadruplex structures with CUT&Tag. Nucleic Acids Res. 2022 Feb 22;50(3):e13.
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